副溶血弧菌檢測方法研究

摘要：副溶血弧菌是一種廣泛存在于水生環(huán)境中的致病性較強的細(xì)菌， 嚴(yán)重危害人和動物健康， 對其進(jìn)行快速檢測研究具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本文綜述了2016-2018年以來副溶血弧菌在分子生物學(xué)、免疫學(xué)和電化學(xué)等方面的最新檢測方法研究進(jìn)展，旨在為副溶血弧菌的快速檢測研究提供參考和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：副溶血弧菌；檢測方法；免疫檢測；電化學(xué)檢測

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus， VP）是屬于弧菌屬的一種具有強致病性病的革蘭氏陰性細(xì)菌，該細(xì)菌嗜鹽，往往會寄生在河流或海洋環(huán)境中的一些浮游生物和水體污染物上。近年來，與副溶血弧菌相關(guān)的臨床病例檢測報告時有報道，而且在世界各地都有過大規(guī)模的流行。因此，副溶血弧菌早期檢測方法的建立對于預(yù)防好控制該菌引起的疾病尤為重要。本文綜述了自2016-2018年以來副溶血弧菌在分子生物學(xué)、免疫學(xué)和電化學(xué)等方面的最新檢測方法研究進(jìn)展，旨在為副溶血弧菌的快速檢測研究提供參考和理論依據(jù)。

1、基于PCR的檢測方法

1.1 常規(guī)PCR方法

PCR技術(shù)是上世紀(jì)后期發(fā)展起來的熱門分子生物學(xué)技術(shù)之一，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)和微生物等領(lǐng)域的快速診斷。目前，基于各種形式的PCR檢測技術(shù)已用于副溶血弧菌的快速檢測。Li等[1]在2016年開發(fā)了一種新的PCR技術(shù)用于副溶血弧菌的快速、準(zhǔn)確檢測，該方法以副溶血弧菌的內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶基因blaCARB-17為檢測靶標(biāo)。該基因比傳統(tǒng)的tlh，toxR和atpA靶標(biāo)基因更加保守，檢測該菌的特異性達(dá)100%。Alaboudi等[2]以副溶血弧菌的gyrB和toxR等基因為靶標(biāo)，利用PCR技術(shù)實現(xiàn)了約旦海岸線的致病性VP的檢測與鑒定。Yang等[3]建立了一種新的RPA-IAC的PCR擴(kuò)增技術(shù)，該方法使用重組聚合酶并結(jié)合一個內(nèi)源性擴(kuò)增對照，在37℃的條件下20 min即可完成擴(kuò)增，其檢測靈敏度可達(dá)3×103CFU/mL。

1.2 實時定量PCR方法

實時定量PCR是在PCR過程中加入熒光染料，通過熒光分子信號監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，并對擴(kuò)增的靶標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。Niu等[4]研制了一種實時熒光定量PCR技術(shù)，以Vp菌的UreR為檢測靶基因，在擴(kuò)增體系中加入疊氮溴化丙錠抑制死細(xì)胞DNA擴(kuò)增，被應(yīng)用于同時檢測和定量活的致病性和非致病性Vp菌株。Xu等[5]建立一種多重實時定量PCR方法，以groEL， tdh和trh檢測模板，實現(xiàn)Vp菌的快速檢測與鑒定，該方法的最低檢測值為104 CFU/mL。

1.3 PCR整合技術(shù)方法

近3年來，越來越多的PCR與其他檢測技術(shù)相結(jié)合，被廣泛用于Vp菌的檢測分析，具體報道如下。Cheng等[6]利用比色法整合PCR，以tdh，trh，tlh和toxR等毒力基因為檢測靶標(biāo)快速檢測Vp菌。Lun等[7]建立了一種基于PCR與免疫磁珠分離現(xiàn)結(jié)合的方法檢測Vp菌及急性肝壞死疾?。ˋHPND），該方法的最低檢測線為CFU/mL。Machado和Bordalo[8]通過最大可能性PCR（MPN-PCR）同時檢測和分析西非幾內(nèi)亞比紹海岸水環(huán)境中的霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌分布，致病性副溶血弧菌的檢測豐度為1.2×103 MPN/L。Wang等[9]建立了一種基于納米金顆粒多重寡核苷酸PCR與生物芯片雜交方法實現(xiàn)同時檢測8種食源性致病細(xì)菌（含副溶血弧菌），該檢測方法的靈敏度為3.3～85 CFU/mL。

1.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification， LMAP）是一種在恒溫條件下快速擴(kuò)增核酸的基因診斷技術(shù)，由于其獨特的擴(kuò)增方式，已被用于各種致病性微生物的快速檢測診斷。Shiddique等[10]以副溶血弧菌的高度保守型groEL基因為檢測靶標(biāo)，利用LMAP技術(shù)實現(xiàn)副溶血弧菌的檢測，其最低檢測線為100 fg/每個反應(yīng)，檢測靈敏度比常規(guī)PCR要高100倍，在模擬海產(chǎn)品和海水中，最低檢測線分別為120 fg和150 fg/每個反應(yīng)。Pang等[11]設(shè)計了一種方法在微流控芯片上利用多色LMAP擴(kuò)增技術(shù)實現(xiàn)副溶血弧菌的定量快速檢測，在污染的食品中和細(xì)菌沒有預(yù)富集條件下該方法的最低檢測閾值為1×103 CFU/mL。Wang等[12]建立了基于多重限制性內(nèi)切酶實時環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)（Multiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermal amplification technology，MERT-LAMP），該方法以副溶血弧菌的toxR和創(chuàng)傷弧菌的rpoS基因為檢測靶標(biāo)，其檢測的靈敏度好，是普通PCR和qPCR的100倍以上，在模擬樣品中的針對副溶血弧菌的檢測閾值為92 CFU/mL。Liu等[13]建立了一種多重環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法在同一個反應(yīng)內(nèi)同時檢測和區(qū)分沙門氏菌和副溶血弧菌。該方法展示了100%的包容性和排他性，并具有和多重PCR相似的檢測閾值。Zhong等[14]以副溶血弧菌tlh，tdh和trh為靶標(biāo)，設(shè)計了6條引物，通過PMA-LMAP等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測并區(qū)分處于活的但不可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable but Non-Culturable， VBNC）和死的狀態(tài)的副溶血弧菌。

2、基于免疫學(xué)的檢測方法

免疫分析法是建立在抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)基礎(chǔ)上的一種新的檢測技術(shù)，可以用各種微生物、蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)的快速檢測分析。Liu等[15]建立了一種高度靈敏的膠體金檢測方法，實現(xiàn)了副溶血弧菌的快速檢測。該方法特異性強，其檢測閾值為1.2×103 CFU/mL。Park和Choi[16]設(shè)計了一種基于液相芯片的免疫分析法，可以在45 min內(nèi)完成對副溶血弧菌進(jìn)行快速靈敏檢測，檢測閾值范圍為101～105 CFU。Liu等[17]利用具有辣根過氧化物酶活性的MnO2納米顆粒標(biāo)記的特異性9肽建立了一種靈敏的比色免疫測定方法，該方法具有較寬的檢測范圍為20～104 CFU/mL，最低檢測線為15 CFU/mL。Fu等[18]建立了一種基于Mn2+介導(dǎo)組裝納米金顆粒的比色免疫分析方法，可以在不富集的條件對海產(chǎn)品中的副溶血弧菌進(jìn)行快速檢測。分析結(jié)果中紅-紫-藍(lán)顏色的變化反映了不同濃度的副溶血弧菌（10～106 CFU/mL），最低檢測線為10 CFU/mL。

3、基于電化學(xué)的檢測方法

電化學(xué)生物傳感器是近年來發(fā)展起來的一門新型檢測技術(shù)，由于其良好的敏感性與選擇性，在生物檢測領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。Nordin等[19]研發(fā)了一種電化學(xué)生物傳感器，以聚乳酸化金顆粒標(biāo)記碳電極為檢測端，而亞甲藍(lán)試劑作為指示劑，用于檢測貝類動物中副溶血弧菌。建立的傳感器能夠特異地區(qū)分完整的、不完整的和錯配的寡核苷酸片段，DNA分子的檢測范圍為2.0×108～2.0×1013 M，最低檢測線為2.16 pM。Nordin等[20]于2018年建立了一種電化學(xué)DNA生物傳感器，用于檢測食源致病性副溶血弧菌，該生物傳感器體現(xiàn)了良好的特異性和檢測應(yīng)用范圍。

4、其他類型檢測方法

除了PCR、免疫學(xué)和電化學(xué)方法以外，也有相關(guān)的其他方法被報道用于檢測或區(qū)分不同類型和狀態(tài)的副溶血弧菌。Yeung和Thorsen[21]設(shè)計并研發(fā)了一種新配方的產(chǎn)色瓊脂培養(yǎng)基，利用不同弧菌在培養(yǎng)基上的產(chǎn)色差異，可以更加直觀和特異的檢測和區(qū)分副溶血弧菌與其他類型弧菌。該方法是多年來僅有的細(xì)菌培養(yǎng)檢測文獻(xiàn)報道，為弧菌的生化鑒定提供了有利的方法，補充現(xiàn)有生化分析方法的不足。Liu等[22]建立了一種基于CdSe/ZnS量子點與納米金之間電荷轉(zhuǎn)移的選擇性熒光“開關(guān)”的副溶血弧菌檢測方法，該方法將IgY抗體與金顆粒偶聯(lián)，借助于量子點與金納米顆粒之間的電荷轉(zhuǎn)移，從而有效介導(dǎo)熒光信號的“開”與“關(guān)”，根據(jù)熒光型號的選擇性轉(zhuǎn)換，實現(xiàn)副溶血弧菌的快速檢測。Yao等[23]設(shè)計了一種新型光譜與核酸相結(jié)合的技術(shù)，在體外利用等溫核酸擴(kuò)增增強物質(zhì)表面拉曼光譜信號，實現(xiàn)副溶血弧菌的超靈敏檢測。該方法的最低檢測線為1 CFU/mL，在模擬樣品的測試中體現(xiàn)出比較滿意的特異性和檢測靈敏度。

5、結(jié)語與展望

綜觀以上副溶血弧菌的檢測方法，近3年的檢測方法中基于PCR的檢測仍占據(jù)主導(dǎo)地位，而其他方法發(fā)展較為迅速，尤其以基于免疫學(xué)和電化學(xué)方法的新型檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn)，在副溶血弧菌檢測中發(fā)揮越來越重要的作用。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和副溶血弧菌檢測的要求，未來仍然需求多元檢測技術(shù)的創(chuàng)新與整合，以求開發(fā)特異性性更強，檢測靈敏度更高和適應(yīng)性更好的檢測新技術(shù)，從而真正實現(xiàn)副溶血弧菌快速、高效的靈敏的檢測與監(jiān)測，保障海產(chǎn)品安全與生命健康。

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通訊作者：汪世華，男，博士，教授，研究方向： 微生物免疫檢測。

基金項目：福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項項目（閩海洋高新[2015]26號）。