重樓皂苷的抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展

錢芳芳 ，闕祖俊 ，田建輝2，#

1上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華臨床醫(yī)學(xué)院，上海200030

2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海200032

3上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)腫瘤研究所，上海200032

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活節(jié)奏的加快，中國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率逐年上升，據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，2014年中國(guó)新發(fā)惡性腫瘤病例約380.4萬例，病死病例229.6萬例，腫瘤發(fā)病率為278.07/10萬，腫瘤病死率達(dá)到167.89/10萬[1]。針對(duì)腫瘤患者的治療，除常見的治療方式如手術(shù)、放療和化療等，中醫(yī)中藥也發(fā)揮著重要的作用，積極挖掘中醫(yī)藥在惡性腫瘤治療中的作用，具有重要的臨床價(jià)值。七葉一枝花為臨床常用的一味中藥，其主要抗腫瘤成分為重樓皂苷，本文對(duì)近年來重樓皂苷在抗腫瘤作用機(jī)制方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 重樓皂苷的抗腫瘤作用

重樓為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖[2]。重樓又名蚤休，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記載，性微寒，味苦，歸肝經(jīng)，有小毒?？捎糜陴郫彴b腫、咽喉腫痛、蛇蟲咬傷、跌撲傷痛、驚風(fēng)抽搐的治療。重樓作為清熱解毒類中藥在臨床腫瘤治療工作中被廣泛應(yīng)用，在抑癌方面也收到了良好的效果[3-4]。同時(shí)，基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)，七葉一枝花能夠明顯抑制肝癌H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，并延長(zhǎng)H22荷瘤小鼠的生存時(shí)間[5]；重樓皂苷I可以抑制人卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)皮下瘤和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)[6]；重樓醇提物及重樓皂苷單體對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株、人卵巢癌細(xì)胞株、胃癌細(xì)胞株、乳腺癌細(xì)胞株均有明顯的抑制作用[7-11]。目前，甾體皂苷被認(rèn)為是重樓提取物中的主要活性物質(zhì)[12]，在抗腫瘤作用中發(fā)揮著重要的作用，其主要通過阻滯腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性等方面發(fā)揮抗腫瘤作用[13-14]。

2 阻滯腫瘤細(xì)胞增殖

細(xì)胞的有絲分裂分為2個(gè)階段：間期和有絲分裂期（S期），其中間期包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（M期）、DNA合成后期（G2期）。生理情況下，各時(shí)期依次交替，細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)蛋白（包括細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶）、原癌基因、抑癌基因、有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白都對(duì)這一環(huán)節(jié)的調(diào)控有著至關(guān)重要的作用，任何一個(gè)環(huán)節(jié)無法順利完成都會(huì)影響細(xì)胞的增殖[15]。暫不分裂的細(xì)胞則進(jìn)入G0期。不同器官來源的腫瘤細(xì)胞經(jīng)重樓皂苷干預(yù)后，會(huì)被阻滯在不同時(shí)期，這提示重樓皂苷可能通過不同的作用機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞的增殖。

王青等[16]研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷I可顯著抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）增殖，且呈現(xiàn)出濃度依賴性，并將CTC周期阻滯在G0/G1期，表明重樓皂苷I可能通過抑制DNA合成從而發(fā)揮抗腫瘤作用。于思等[17]研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I可抑制HCT116細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響到紡錘體的形成，從而將HCT116細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。Cai等[18]研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷G可誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞系OECM-1細(xì)胞周期停滯在G2/M期；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷G通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)途徑關(guān)鍵激酶毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)突變（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）蛋白激酶，進(jìn)而刺激ATM下游的檢測(cè)點(diǎn)激酶1/2（checkpoint kinase 1/2，Chk 1/2），使細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cyclin 25 homolog C，cdc25C）抑制性磷酸化水平增加，最終導(dǎo)致周期素B1和細(xì)胞分裂周期蛋白2復(fù)合物失活，從而使細(xì)胞周期停滯在G2/M期。

3 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞程序性死亡又稱凋亡，是指在基因調(diào)控下細(xì)胞進(jìn)行的一系列有序的自毀過程。經(jīng)典的凋亡途徑包括死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑，因此可通過對(duì)死亡受體、線粒體、凋亡抑制蛋白和天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）等多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)達(dá)到誘導(dǎo)凋亡的目的[19]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是治療腫瘤的一條重要途徑。

3.1 影響線粒體途徑促進(jìn)凋亡

細(xì)胞在受到外界有害物質(zhì)刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），破壞了細(xì)胞內(nèi)原本的抗氧化保護(hù)機(jī)制之間的平衡，引起細(xì)胞組織的損傷，線粒體膜表面去極化，膜電位發(fā)生改變，引起細(xì)胞色素C的釋放，這一過程在細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用。

程卉等[20]通過觀察不同濃度的重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16增殖的影響，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅱ可顯著抑制B16細(xì)胞的增殖，且具有時(shí)間和濃度依賴性；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞內(nèi)ROS的含量顯著提高，線粒體膜電位水平隨著藥物濃度的升高而降低，由此表明，重樓皂苷Ⅱ可能通過線粒體氧化應(yīng)激通路從而誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡。陳舒怡等[21]通過熒光顯微鏡觀察到重樓皂苷I作用于人肺癌NCI-H661細(xì)胞后，隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)線粒體的熒光強(qiáng)度逐漸減弱至消失；研究者還更加直觀地觀察到重樓皂苷I作用2 min后，大鼠腦皮質(zhì)海馬神經(jīng)元線粒體發(fā)生碎裂，表明重樓皂苷I可通過促進(jìn)線粒體碎裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅶ可誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能為ROS通路介導(dǎo)的線粒體途徑的激活和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、抑癌基因PTEN、p53通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

3.2 影響凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（蛋白表達(dá)）

在凋亡的過程中，caspase家族在凋亡信號(hào)的傳遞過程中起著重要的作用，細(xì)胞色素C釋放后與凋亡相關(guān)因子結(jié)合形成多聚體，再與caspase 9結(jié)合形成凋亡小體，活化的caspase 9激活下游的蛋白如caspase 3，啟動(dòng)凋亡。王青等[23]檢測(cè)了重樓總皂苷作用于A549細(xì)胞后凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的變化，研究結(jié)果表明重樓總皂苷可顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，并上調(diào)促凋亡蛋白caspase 3的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤因子-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達(dá)。蔡虹和楊春輝[24]研究重樓皂苷D對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562的作用，結(jié)果表明重樓皂苷D通過上調(diào)細(xì)胞色素C、caspase 3和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X，BAX）的表達(dá)，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。Watanabe等[25]研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷D通過上調(diào)caspase 3/7/8的表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤NB-69細(xì)胞株發(fā)生凋亡。

3.3 調(diào)控細(xì)胞因子

腫瘤細(xì)胞并非孤立存在，而是與周圍組織結(jié)構(gòu)一起存在于機(jī)體。腫瘤細(xì)胞以及周圍存在的基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子等一起組成了腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境在調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的過程中非常關(guān)鍵[26]。腫瘤微環(huán)境中各組成成分的變化影響著腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。滕文靜等[27]研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷可能通過下調(diào)白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的分泌，抑制JAK/STAT3信號(hào)通路的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞凋亡。鄧碧凡等[28]通過實(shí)驗(yàn)研究觀察到重樓皂苷I能夠降低低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，影響腫瘤微環(huán)境中含氧量和腫瘤血管生成，從而抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖。

4 抗血管生成

腫瘤細(xì)胞具有無限增殖的能力，這一過程需要豐富的血管為其輸送營(yíng)養(yǎng)成分，持續(xù)的血管生成被列為腫瘤的十大特征之一[29]。因此，抑制腫瘤血管生成可以切斷腫瘤細(xì)胞的養(yǎng)分供給，從而達(dá)到抗腫瘤的作用。王娓娓等[30]通過研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I可以抑制冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，降低細(xì)胞活力、鈣黏蛋白mRNA的表達(dá)，增加caspase 3mRNA的表達(dá)。畢葳等[31]通過提取重樓皂苷I、重樓皂苷Ⅱ、纖細(xì)薯蕷皂苷，觀察其干預(yù)雞胚絨毛尿囊膜后對(duì)血管生長(zhǎng)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干預(yù)組相比空白組小血管數(shù)目明顯減少，其中重樓皂苷I組與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明重樓皂苷I有抑制血管生成的作用。Wnt5A屬于Wnt蛋白家族的成員之一，其在組織中的表達(dá)與血管新生密切相關(guān)。Gu等[6]研究重樓皂苷I對(duì)人卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞株接種的裸鼠皮下瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤的影響，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I可能是通過調(diào)控caspase 9、C-jun和Wnt5A的表達(dá)，從而對(duì)腫瘤有明顯的抑制作用。

5 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移

近年來，針對(duì)腫瘤的治療策略逐漸從“治瘤”向“治人”的方向轉(zhuǎn)變，“人瘤并存”[32]的思想也越來越得到學(xué)術(shù)界和臨床醫(yī)師的認(rèn)可。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，失去了正常的分化能力，因此可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化來“改造”腫瘤細(xì)胞。有研究表明，重樓皂苷D能夠顯著上調(diào)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞表面分化抗原CD14的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞向單核-巨噬細(xì)胞分化[24]。

腫瘤患者的治療原則始終貫徹的是防治復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，腫瘤患者一旦出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，將對(duì)患者的生活質(zhì)量和治療信心產(chǎn)生巨大的影響。因此，防治復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是術(shù)后患者治療的首要目的。牟海軍等[33]通過研究重樓皂苷聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)移的影響，探討重樓皂苷聯(lián)合順鉑抗肺癌的增效機(jī)制，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷聯(lián)合順鉑在誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡和減少腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面具有協(xié)同增效作用。Gu等[34]研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I可以下調(diào)人卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞PIK3C2B和Wnt5A的表達(dá)，從而抑制HO-8910PM細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

6 逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性

在臨床治療中，晚期腫瘤患者大多數(shù)都會(huì)經(jīng)過化療、放療、靶向治療等多學(xué)科綜合治療，腫瘤細(xì)胞在這一過程中容易產(chǎn)生耐藥性，使治療不能達(dá)到理想的效果，或者容易產(chǎn)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，增強(qiáng)藥物對(duì)耐藥細(xì)胞株的損傷作用，可能為開發(fā)新藥提供思路。龐曉輝等[35]利用大劑量沖擊法成功誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480/L-OHP和LoVo/L-OHP，并觀察到重樓皂苷I能夠通過上調(diào)BAX、caspase 3蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)腸癌及其耐藥株發(fā)生凋亡。Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅶ可以通過調(diào)控P21信號(hào)通路和誘導(dǎo)G1期細(xì)胞阻滯增強(qiáng)獲得性耐吉非替尼H1975細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的敏感性，從而為克服獲得性表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制藥（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）耐藥非小細(xì)胞肺癌提供了新思路。

7 小結(jié)

近年來，中醫(yī)藥在腫瘤治療中的優(yōu)勢(shì)得以凸顯，中西醫(yī)在惡性腫瘤的治療理念、療效評(píng)價(jià)等方面逐漸趨同，中西醫(yī)結(jié)合治療成為趨勢(shì)[37]。中藥及其提取物因多靶點(diǎn)抗腫瘤作用機(jī)制在臨床實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。重樓作為臨床常用的抗腫瘤藥物，其主要活性物質(zhì)重樓皂苷的抗腫瘤作用在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域也得到證實(shí)。不斷探索重樓皂苷抗腫瘤的具體作用機(jī)制，發(fā)掘重樓皂苷類及其他中藥單體的抗腫瘤作用，為提高臨床療效找到更多更有效的路徑。未來對(duì)于中藥及其單體的研究可在以下方面進(jìn)行深入探討：①給藥方式的改變。隨著藥物提取方法的改進(jìn)和現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的發(fā)展，單體濃度和純度更有保障，給藥方式也有創(chuàng)新。例如可借鑒納米技術(shù)完成重樓皂苷的給藥，以期提高藥物到達(dá)靶細(xì)胞的效率，提高針對(duì)靶細(xì)胞的“特異性”治療作用，從而提高臨床療效[38]。②不同單體的聯(lián)合用藥，研究中西醫(yī)藥物的協(xié)同增效作用及其機(jī)制。中藥方劑遵從“配伍”的原則，力求使臨床療效達(dá)到最優(yōu)。不同藥物可通過不同的機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，聯(lián)合用藥則與中藥配伍殊途同歸，例如中藥單體聯(lián)合[39]、中藥及其單體與化療藥物、分子靶向藥物的結(jié)合[40]，可共同作用于腫瘤細(xì)胞，提高療效，降低不良反應(yīng)對(duì)患者生存質(zhì)量的影響。③優(yōu)化研究平臺(tái)。目前針對(duì)腫瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)研究多采用二維培養(yǎng)體系，體內(nèi)多采用皮下移植瘤模型等。事實(shí)上，這種培養(yǎng)模式與腫瘤發(fā)病的臨床實(shí)際有一定差距。符合腫瘤臨床實(shí)際的發(fā)病模型可更客觀地評(píng)估藥物的實(shí)際藥理作用和機(jī)制。例如肺癌原位移植瘤[41]、研究腫瘤轉(zhuǎn)移專用的CTC體外研究體系[42]、三維體外細(xì)胞模型的應(yīng)用[43]等，技術(shù)的革新與發(fā)展，必將加快新藥研發(fā)的速度，為攻克臨床治療腫瘤的難題提供新的機(jī)遇和思路。