雜交鏈反應在生物傳感檢測技術中的應用

梁棟國，陳星兆，吳宏祥，張 曄,2，羅世華,2 綜述 鄭 磊,2 審校

核酸擴增技術可以分為兩類：一類是熱循環(huán)擴增技術，包括多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)和連接酶鏈式反應(ligase chain reaction,LCR)；另一類是等溫擴增技術，包括螺旋酶依賴性擴增(helicase-dependent amplification,HDA)，滾環(huán)擴增(rolling circle amplification,RCA)和鏈置換擴增(strand displacement amplification,SDA)，如酶介導SDA(如多聚酶介導SDA)和無酶SDA[如立足點介導的鏈置換(toehold-mediated strand displacement,TMSD)擴增]。與熱循環(huán)擴增法相比，等溫擴增法可在簡單條件下(如恒溫)進行，而前者往往需要復雜的條件。需要特別指出的是，由于具有無需酶介導、擴增效率高和反應動力學可控等優(yōu)點，TMSD擴增已成為最受歡迎的一種等溫擴增法。在一次典型的TMSD反應中，擴增反應開始于互補單鏈的末端(稱為立足點，接著一條長單鏈DNA取代一條短鏈，并通過更多的互補堿基對，與第三條鏈雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。已發(fā)現(xiàn)，立足點堿基的數(shù)目和種類調(diào)控鏈置換反應的動力學。理論上，TMSD可將鏈置換速率提升106倍。在TMSD體系中，雜交鏈反應(hybridization chain reaction,HCR)是于2004年由Dirks et al[1]提出的一種簡單高效的等溫擴增技術，以核酸探針之間競爭雜交作為能量來源，自組裝成一種核酸納米結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)信號的放大。HCR的組成元件包括：引發(fā)探針和兩條可雜交互補并帶有粘性末端的發(fā)夾型DNA(H1和H2)。若無引發(fā)序列存在時，兩條發(fā)夾型 DNA 可以穩(wěn)定存在，一旦存在引發(fā)探針，發(fā)夾H1的二級結(jié)構(gòu)被引發(fā)探針打開，H1釋放的莖端會將發(fā)夾H2的二級結(jié)構(gòu)打開，H2釋放出的莖端與引發(fā)探針的序列相同，又會打開H1的二級結(jié)構(gòu)，H1和H2如此循環(huán)往復的被相互打開，最后形成一條含有缺口的雜交長雙鏈共聚。由于具有無需酶介導、等溫擴增效率高、靈敏度極高和結(jié)構(gòu)靈活等特點，HCR已被認為是一種強大的分子工具，并廣泛應用在生物傳感、生物成像和生物醫(yī)藥等領域。迄今為止，HCR已用于包括核酸(DNA或RNA)、蛋白質(zhì)、酶活性、生物小分子、金屬離子、甚至是腫瘤細胞、在內(nèi)的多種靶物質(zhì)的敏感檢測。

1 HCR的基本特征

Dirks et al[1]引入了一種新的策略，DNA可以通過與底物結(jié)合同時完成識別和信號放大。在典型的HCR過程中，靶向的識別啟動兩個DNA發(fā)夾的交叉開放以形成DNA聚合物納米線。

2007年，該課題組提出了一種自主聚合馬達，靶觸發(fā)四向分支遷移以進行HCR，從而形成長切口雙螺旋DNA。與傳統(tǒng)PCR分析技術不同，HCR是一種等溫和無酶擴增策略。 HCR和PCR之間的另一個顯著差異在于HCR是一種探針擴增技術，而PCR是一種靶向擴增技術。因此，HCR可有效降低PCR中常發(fā)生的擴增子的假陽性和交叉污染。

HCR的關鍵要素是兩個輔助發(fā)夾，包含三個結(jié)構(gòu)域：立足點、莖和環(huán)。在發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，短環(huán)由長莖保護以存儲勢能。HCR的動力學可以通過改變立足點序列的長度和結(jié)合強度來精確控制。因此，為了可編程地控制HCR過程，立足點的序列和長度是HCR合理設計的關鍵因素。一般來說，如果立足點長度太短，HCR就無法有效啟動。當立足點長度約為6～10個核苷酸時，反應速率可保持穩(wěn)定，且?guī)缀醪蛔儭Ｗ罱?，Ang et al[2]設計了一套四點設計方案，用于設計發(fā)夾持柄和莖區(qū)的長度和堿基對GC含量，以提高HCR的動力學。到目前為止，已經(jīng)報道了用于激活和控制PCR過程的各種新穎的策略，例如光活化、pH控制和臨近啟動。

2 在核酸檢測方面的應用

核酸，包含DNA和RNA，作為疾病特別是癌癥早期診斷的特異性標志物，是當下熱門的生物大分子。因此，具有特異性和靈敏性的核酸檢測在生物醫(yī)藥研究及臨床診斷中至關重要。為了實現(xiàn)這一目標，人們已經(jīng)為核酸檢測開發(fā)出多種基于HCR的方法。

2.1在溶液中檢測在基于均質(zhì)溶液的HCR核酸檢測中，靶DNA或RNA作為起始物觸發(fā)動力學上相互遏制的發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)生雜交，形成DNA納米線聚合物。通過引入多種標記產(chǎn)生信號，含有上千個重復序列的HCR產(chǎn)物成為優(yōu)質(zhì)的核酸檢測等溫擴增平臺。Huang et al[3]提出了基于HCR中芘標記發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA檢測系統(tǒng)。芘基在3’和5’末端修飾了兩個發(fā)夾探針H1和H2。在缺乏靶物質(zhì)的情況下，兩個芘基殘端在空間上相互分離，出現(xiàn)強單體發(fā)射峰(在375 nm和398 nm處)。靶物質(zhì)存在時，將啟動HCR形成有切口雙螺旋結(jié)構(gòu)，使兩個發(fā)夾結(jié)構(gòu)上的芘單位靠近。該方法實現(xiàn)了對濃度低至256 fmol/L的DNA的測量，并成功用于復雜體液的核酸定量檢測。作為無標志物生物傳感器的熒光指示劑，發(fā)光納米超微粒(Nano-particles,NP)也成為了當下的熱點。將HCR擴增法與高熒光銀納米團簇顆粒整合形成新的熒光生物感應平臺，用于microRNA let-7a檢測和microRNA let-7a家族中單個核苷酸多態(tài)性的鑒別[4]。

鑒于成本低、操作簡單和實用的優(yōu)點，比色檢測法成為了核酸檢測的焦點。其中基于金納米粒子的比色傳感器在DNA的檢測中主要有兩種類型：第一種是三元夾心法，通過粒間的交聯(lián)機制誘導金納米粒子間的交聯(lián)；第二種是根據(jù)單鏈 DNA(ssDNA) 和雙鏈DNA(dsDNA)與未改性的金納米粒子(Au Nanoparticles,AuNP)特性的差異。由于不需要對AuNP進行共價功能化，在核酸的可視分析中該法具有明顯優(yōu)勢[5]。即使靶DNA濃度低至100 pmol/L，也可用肉眼識別，而使用分光光度計可檢測到50 pmol/L的DNA。

近期，Lu et al[6]在HCR觸發(fā)酶級聯(lián)擴增法的基礎上開發(fā)出一套超敏比色法。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase enzyme,GOx)和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)修飾兩個用于此法的DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而后加入靶核酸啟動HCR，形成GOx/HRP復合酶。搭載這一特性的HCR擴增法將靶核酸檢測限降低到5.2 fmol/L。

2.2固相檢測在基于HCR的固相核酸分析法中，HCR發(fā)生在諸如電極、微粒體或納米粒子(nanoparticles，NP)、微孔板、玻璃芯片或微流體工具表面。固相檢測的主要優(yōu)點是能容易地將分析物從復雜樣品矩陣中分離。此外，這些檢測可靈活使用于光學或電化學檢測中，在即時檢測(point-of-care testing,POCT)環(huán)境的高通量分析和發(fā)展中具有巨大潛力。

作為一種便捷、靈敏和高性價比的檢測技術，基于HCR的電化學檢測技術已引起廣泛關注。Yang et al[7]提出了一種無酶、無共軛的電化學基因檢測技術。在該法中，捕獲探針經(jīng)Au-S鍵固定于電極表面。當引入靶DNA，起始鏈和靶鏈發(fā)生三聯(lián)雜交，啟動HCR，形成線性、電負性串聯(lián)體。此后，電化學指示劑[Ru(NH3)6]3+通過靜電吸附與DNA發(fā)生反應。基于HCR的電化學生物檢測法擁有極高靈敏度(檢測限低至1 amol/L)，可精確識別乳腺癌BRCA1基因，準確區(qū)分單堿基錯配序列。

在光學固相檢測中，微粒體或NP、玻片通常作為固定HCR產(chǎn)物的載體。Liu et al[8]報告了一種基于發(fā)光半導體量子點(quantum dots,QDs)、磁性微珠(magnetic microspheres,MMP)和HCR檢測特定序列單鏈DNA的方法：氨基修飾的DNA(Amino-modified DNA,A DNA)能夠與靶DNA的3’末端雜交以及和MMP結(jié)合，捕獲DNA的3’末端與靶DNA的5’末端雜交，其5’末端與H1雜交，H1與H2雜交以此反復形成循環(huán)，以一種復雜的釕復合物(Ru(bpy)2(dppx)2+(bpy=2.2’-聯(lián)吡啶, dppx=7,8-二甲基二吡啶))插入HCR產(chǎn)物并且與QDs結(jié)合改變其發(fā)光波長為原理，達到檢測特定序列單鏈DNA的目的，其檢測限度低至6.75×10-14mol/L。類似地，Niu et al[9]也報告了一種可在磁性微粒上靈敏并選擇性檢測DNA的擴增法，該法將磁性微粒與HCR整合，并引入酶促進反應。由此實現(xiàn)了對靶DNA的超敏檢測，檢測限低至8.1×10-16mol/L。盡管擁有著極高的靈敏度，該法仍存在標記(如生物素和卵白素修飾)昂貴和信號分子固定過程復雜(如生物素卵白素相互作用)的缺點。此外，研究者[10]還在分支HCR聚合作用與采用SYBR I型綠色染料的基礎上，提出了一種用于高通量RNA檢測的無標記熒光法。

3 在蛋白質(zhì)檢測方面的應用

蛋白質(zhì)是維持生命的基礎，已證實蛋白質(zhì)功能障礙可引起多種疾病[11]。此外，許多蛋白質(zhì)在實際樣品中的含量極低。因此，蛋白質(zhì)高靈敏度檢測在生物分析中起著重要的作用。HCR，作為當下熱門的無酶等溫擴增技術，已廣泛應用于蛋白質(zhì)的靈敏檢測。根據(jù)識別機制，這些方法可分為兩類：基于抗體的方法和基于適配體的方法。

3.1基于抗體的方法在基礎研究和臨床診斷中，由于能與抗原表位特異性結(jié)合，作為配體的抗體廣泛應用于蛋白質(zhì)的定量檢測。在蛋白質(zhì)檢測中最常見的抗體法是ELISA，其檢測靈敏度仍亟待提高。此外，在HCR擴增法的基礎上將特定DNA與抗體結(jié)合，誕生了免疫HCR法。這些檢測法背后的原理主要如下：① 在固體基質(zhì)(如磁珠、玻片或電極)表面形成捕獲抗體(Ab1)/靶蛋白/輔抗體(Ab2)三聯(lián)免疫復合物；② 利用依附于Ab2的寡核苷酸啟動HCR；③ 利用光學或電化學技術定量檢測免疫HCR產(chǎn)物?；谏鲜鲈?，Choi et al[12]開發(fā)出一套熒光檢測法，用于檢測單個人類單核細胞分泌的細胞因子和趨化因子。相較其它未采用HCR擴增的熒光檢測法相比，該法的檢測限和靈敏度平均提高了200倍。Li et al[13]則基于官能化磁性顆粒富集和雜交鏈反應(HCR)擴增，開發(fā)一種超敏感化學發(fā)光生物傳感器，以進行蛋白質(zhì)的檢測，其檢測限可低至9.7 fmol/L，并且添加不同的適配體，就可以對相應蛋白進行檢測。還可以通過改變添加試劑的順序，實現(xiàn)處在復雜生物環(huán)境的蛋白質(zhì)的檢測。這意味著，該策略有著極大的臨床應用價值以及前景。

此外，Zhao et al[14]研發(fā)出一種基于HCR反應輔助形成銅納米顆粒(Cu,nanoparticles,CuNPs)的蛋白電化學檢測方法。該團隊以葉酸受體作為例子，在葉酸受體和葉酸結(jié)合后，探針DNA免受核酸外切酶I的降解，進而與捕獲DNA雜交，被固定在電極表面，并促發(fā)位于電極表面上的HCR反應，生成CuNPs，隨后生成的銅離子催化鄰苯二胺的氧化，通過級聯(lián)反應，實現(xiàn)電化學信號的放大。該法可實現(xiàn)濃度位于0.01 ng/ml到100 ng/ml的葉酸受體的檢測，最低濃度可達3 pg/ml。另外，以金納米粒子(AuNP)為信號擴增的DNA誘發(fā)劑載體，構(gòu)建出了電化學免疫HCR生物傳感器[15]。AuNP可大幅度增加DNA誘發(fā)劑劑量，產(chǎn)生更多的HCR產(chǎn)物，提升靶蛋白質(zhì)定量的信號放大能力，將檢測濃度閾值降低到0.1 fg /ml。

3.2基于適配體的方法適配體是利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術從隨機種群DNA/RNA中獲得的ssDNA或RNA分子[16]。作為另一種親和配體，具有高親和力和特異性的適配體廣泛用于靶物質(zhì)如蛋白質(zhì)、小分子甚至是整個細胞的識別[17]。與抗體相比，適配體有著諸如合成容易、修飾簡單、成本低廉、貯存時間長和無毒等多項優(yōu)點。

近年來，已開發(fā)出多種基于HCR的適配體檢測方法，用于蛋白質(zhì)檢測。基于靶向促發(fā)HCR擴增和氧化石墨烯(graphene oxide,GO)的選擇性熒光猝滅，Wang et al[18]已經(jīng)開發(fā)出一種新穎的無酶無標記物的熒光適配體傳感策略，并成功應用于血小板衍生生長因子BB(platelet derived growth factor BB,PDGF-BB)的檢測。而PDGF-BB在細胞轉(zhuǎn)化腫瘤生長和進展等扮演重要角色。所以，該方法將可以用于腫瘤細胞的早期檢測與診斷。用于蛋白質(zhì)(如PDGF-BB)檢測的經(jīng)典適配體檢測劑由適配體與HCR整合獲得[19]。靶適配體首先啟動生物素酰化DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)雜交，形成長DNA切口雙螺旋，后者再與SA-QD反應生成QD-DNA共軛。在靶適配體識別的基礎上，QD-DNA共軛與先前抗體捕獲的PDGF-BB在液面結(jié)合，以熒光檢測PDGF-BB，檢測限為50 pmol/L。另外，還有一種以HCR為信號擴增，基于適配體的普適表面增強拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)生物檢測方案[20]。該法形成了基于Watson Crick and Hoogsteen堿基對的DNA三螺旋探針設計。靶物質(zhì)與適配體的結(jié)合擾動了三螺旋結(jié)構(gòu)并使得從硅微球體獲得的普適誘發(fā)劑發(fā)生解離，從而啟動了HCR。AuNP再與HCR產(chǎn)物共軛，形成SERS活性熱點。該SERS生物檢測劑已用于檢測多種靶物質(zhì)，包括凝血酶、腺苷和癌細胞。

4 在酶活性檢測方面的應用

酶是能夠選擇性并具有催化活性的特殊蛋白質(zhì)，在幾乎所有的生命活動中發(fā)揮著關鍵作用。研究者已發(fā)現(xiàn)一些酶[如端粒酶、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase,MT酶)和核苷酸激酶(nucleotide kinase,PNK)]可以作為疾病的生物標志物。因此，開發(fā)簡便快速敏感的酶活性檢測方法有利于推動生物醫(yī)藥和臨床研究的發(fā)展，有利于疾病的早期診斷。

至今，已出現(xiàn)多種基于HCR進行酶活性分析的生物傳感策略。Zhang et al[21]提出了一種基于HCR的流式細胞磁珠檢測法，用于超敏檢測T4多聚核苷酸激酶 (T4 polynucleotide kinase, T4PNK)的活性。在缺乏T4PNK的時候，閉式DNA的5’羥基末端無法磷酸化。因此，核酸外切酶I無法分解閉式DNA，阻止了HCR反應。反之，若樣品中存在T4PNK，將觸發(fā)磁珠表面HCR反應。流式細胞儀可直接分析磁珠上的熒光，良好地實現(xiàn)對T4PNK活性的定量分析，檢測限達到4×10-6U/ml。另外，張佳玉 等[22]也利用HCR無酶放大檢測信號, 建立了一種簡單、快速的端粒酶活性檢測方法。在優(yōu)化條件下,可以檢測到1.0×105個Hela細胞中的端粒酶活性，進一步推動了腫瘤或癌癥的早期臨床診斷以及以端粒酶為靶標分子的抗癌藥物的篩選。利用HCR同樣可以檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及其抑制劑的活性[23]。此外，一套普適核酸酶反應HCR法已經(jīng)問世[24]。通過對特定核酸酶位點進行合適的三通設計，該法還可用于多種DNA修飾酶的檢測，未來還可用于構(gòu)建具有多種用途的靶敏感DNA產(chǎn)物。

5 在腫瘤細胞檢測方面的應用

腫瘤細胞表面或細胞內(nèi)某些生物標志物如受體、蛋白質(zhì)或特異性酶的表達水平，與正常值之間存在顯著差異，為癌癥的早期診斷和治療提供了機會[11]。至今，已有許多研究報道了通過識別包膜表面的生物標志物來檢測癌細胞[25]。其它胞內(nèi)腫瘤標志物(如核酸、蛋白質(zhì))的檢測往往涉及到復雜的流程，而對于整個腫瘤細胞的直接檢測則相對簡單而高效。鑒于細胞表面情況復雜且含有不同分子[26]，特別是蛋白質(zhì)，非常適合開發(fā)出一套用于癌細胞檢測的無酶擴增法。為此，人們已經(jīng)開發(fā)出了一套通過識別適配體來檢測癌細胞的多分支HCR(multi-branched HCR,mHCR)法[27]。mHCR是利用經(jīng)典的HCR反應生成長產(chǎn)物，帶有多個用于信號放大的指示分子和與DNA四面體納米金電極多價結(jié)合的支臂。由于mHCR擴增和多價結(jié)合的協(xié)同作用，這套生物傳感方案擁有極高的靈敏度，檢測限達到了4個MCF-7細胞的水平。

一種無標記法也是通過在HCR產(chǎn)物基礎上將NP金屬化獲得[28]。在該法中，首先將適配體序列(DNAa)和信使DNA(DNAb)雜交，形成一段部分互補雙鏈。在靶細胞存在時，適配體與之特異性結(jié)合，釋放DNAb從而觸發(fā)HCR。所合成的長雙鏈DNA低聚體成為原位合成帶有強熒光CuNP的模板，后者進一步作為輸出信號，用于無標記定量檢測腫瘤細胞，檢測限為50個細胞。

6 展望

盡管基于HCR的方法已歷經(jīng)了長足的發(fā)展, 但在生物傳感領域的的應用仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。① 在HCR中, 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的設計至關重要。事實上, 該結(jié)構(gòu)的微小變化可能導致反應的失敗。人們已經(jīng)為構(gòu)建創(chuàng)造性的分子設計系統(tǒng)付出了巨大的努力。雖然已經(jīng)取得了長足的進展, 但是仍缺乏能系統(tǒng)地設計發(fā)夾序列的指導方針。② 一般情況下, HCR可搭載各種信號顯示技術, 諸如熒光、化學發(fā)光、比色和電化學法, 以實現(xiàn)對靶物質(zhì)的靈敏檢測。然而, 僅依靠HCR擴增的策略往往不能為生物傳感提供足夠的靈敏度。為進一步提高靈敏度，人們提出了多酶HCR策略。其靈敏度優(yōu)于PCR，檢測范圍達到了amol級別。盡管多酶HCR策略有著極高的靈敏度，但是嚴格的流程和苛刻的反應條件使得在HCR中使用酶與提升檢測靈敏度相悖，并限制了其在復雜樣本分析中的應用。因此，基于HCR的理想生物檢測方式應當是完全無酶的。此外，尚在研發(fā)階段的功能性核酸，尤其是DNA酶，推動無酶HCR范式的建立。HCR介導的諸如血晶素、G-四聯(lián)體等DNA酶產(chǎn)物的合成，不僅提高了檢測靈敏度，還克服了酶輔HCR策略的缺陷。③ 針對異質(zhì)HCR,由于可能觸發(fā)非特異性的吸附和空間位阻效應并限制反應效率，調(diào)控固體底物表面DNA探針的密度和方向成為了當務之急。盡管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和機械剛度，使在固體表面充當支架的DNA四面體在一定程度上解決了這個問題，但是在固體底物上可編程地控制固定分子探針仍然充滿挑戰(zhàn)。④ 近年來, 通過觸發(fā)啟動復雜DNA單體的自組裝, 分支甚至樹突狀HCR系統(tǒng)得以發(fā)展, 實現(xiàn)了二次甚至是指數(shù)增長機制。然而, 這些非線性的HCR策略依舊受限。因此，有必要將HCR與其他等溫機制整合以構(gòu)建更復雜的DNA結(jié)構(gòu)。⑤ 得益于適配體的發(fā)展，HCR擴增法已應用于從小分子、核酸、蛋白質(zhì)、到細胞水平的大范圍檢測。然而，數(shù)量有限的適配體限制了基于適配體HCR法的發(fā)展。⑥ 雖然當下多數(shù)基于HCR的生物分析法仍處于實驗階段，實際應用也面對諸多困難。隨著HCR研究的不斷深入，這些問題都將可以被克服。在物理和工程學等其它領域，應側(cè)重在HCR的基礎上獲得簡單但靈敏的“采樣-反饋”特性，助力POCT的臨床應用。