HPLC—MS/MS法同時(shí)測(cè)定蔬菜中38種農(nóng)藥殘留

摘 要：利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）技術(shù)，建立了蔬菜中38種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。樣品以乙腈為提取溶劑，高速勻漿提取，氯化鈉脫水，高速離心分層，提取液經(jīng)氨基固相萃取小柱凈化，利用HPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：38種農(nóng)藥在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.975～0.999；其中，豇豆和辣椒樣品在0.01 mg/kg添加水平下回收率分別為72.6%～119.6%和76.5%～118.2%，在0.10 mg/kg添加水平下回收率分別為71.5%～119.4%和75.5%～119.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)；該方法的定量下限為0.002 mg/kg。經(jīng)驗(yàn)證，該方法具有靈敏度高、選擇性好、回收率高且穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，用于實(shí)際蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留的測(cè)定，結(jié)果較為滿意。

關(guān)鍵詞：蔬菜；農(nóng)殘檢測(cè)；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）06-0091-05

Simultaneous Determination of 38 Pesticide Residues in Vegetables by HPLC-MS/MS Method

ZHANG Wei-jun

（Liuyang Agricultural Product Quality Monitoring Center， Changsha 410300， PRC）

Abstract： Thirty and eight pesticide residues in vegetables were detected simultaneously by Hplc-MS/MS. Using acetonitrile as extraction solvent， the sample was first extracted with high speed homogenate， then dehydrated with NaCl and stratified by high speed centrifugation， the extraction liquid was purified by amino-solid extraction column and determinate by HPLC-MS /MS. The results showed that 38 kings of pesticides have good linearity within a certain mass concentration range， and the correlation coefficient is 0.975-0.999. The recovery rates of cowpea and pepper samples were 72.6%-119.6% and 76.5%-118.2% respectively， at the addition level of 0.01 mg/kg； the recovery rates were 71.5%-119.4% and 75.5%-119.2% respectively， at the addition level of 0.10 mg /kg. The relative standard deviation was within 10%. The quantitative lower limit of this method is 0.002 mg/kg. In conclusion， HPLC-MS/MS has the advantages of high sensitivity， good selectivity， high recovery and stability， and can be used for determination of pesticide residues in real vegetable samples.

Key words： vegetable； detection of pesticide residue； HPLC-MS/MS

蔬菜是人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮偈澄镏唬瑸榱丝s短蔬菜的生長(zhǎng)期、提高產(chǎn)量并減少病蟲(chóng)害的影響，各類化肥和農(nóng)藥廣泛使用，對(duì)蔬菜造成不同程度的污染。近年來(lái)，隨著各國(guó)對(duì)食品安全問(wèn)題的重視，蔬菜中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求越來(lái)越嚴(yán)格，我國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)蔬菜農(nóng)藥殘留例行監(jiān)測(cè)的種類多達(dá)58種[1-5]。要完成這58種農(nóng)藥殘留檢測(cè)，按照傳統(tǒng)色譜技術(shù)至少需要?dú)庀嗌V儀和液相色譜儀，并且配置4個(gè)不同的檢測(cè)器。近年來(lái)，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為多農(nóng)藥殘留的檢測(cè)手段越來(lái)越受到人們的青睞。尤其是HPLC-MS/MS技術(shù)，HPLC可以實(shí)現(xiàn)多種農(nóng)藥快速分離，串聯(lián)質(zhì)譜可以對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥準(zhǔn)確定性，并提高檢測(cè)靈敏度，三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下具有更好的檢測(cè)靈敏度和選擇性，大大降低了假陽(yáng)性分析結(jié)果的概率，非常適合蔬菜中低含量多農(nóng)藥殘留物的分析[6-9]。豇豆和辣椒是湖南省種植較多的蔬菜品種，也是農(nóng)藥使用量較大、容易出現(xiàn)農(nóng)藥殘留超標(biāo)的蔬菜品種，筆者以辣椒、豇豆等10種蔬菜為研究樣品，建立了甲胺磷、乙酰甲胺磷等38 種農(nóng)藥的HPLC-MS/MS 檢測(cè)方法，對(duì)儀器條件、前處理方法進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于蔬菜農(nóng)藥的快速檢測(cè)分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)主要儀器有高效液相色譜—三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（e2695-TQD，ESI源） 和 XBridgeBEH C18柱[100 mm × 2.1 mm×2.7μm，美國(guó)Waters公司）、氮吹儀（美國(guó) Organomation公司）、均質(zhì)機(jī)（T18，德國(guó) IKA 公司）、超純水純化系統(tǒng)（milli-Q reference，Millipore公司）、C18氨基固相萃取柱（3 cc，500 mg， 美國(guó)waters公司）、針式過(guò)濾器（0.22 μm，PTFE，天津德祥）、高速離心機(jī)（湖南湘儀）、攪拌器（珠海飛利蒲電器公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生儀器廠）。

試驗(yàn)主要試劑有甲醇、乙腈、甲苯（色譜純，Merck公司）；超純水；甲酸（96%）、 乙酸銨（均為德國(guó)CNW公司產(chǎn)品）；氯化鈉（分析純，140 ℃烘干4 h）。38種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測(cè)所）。

待測(cè)蔬菜樣品來(lái)源于5家蔬菜生產(chǎn)單位，采集了黃瓜、普通白菜、番茄、茄子、辣椒、結(jié)球白菜、萵筍、葉芥菜、菜薹、甘薯葉等10種蔬菜樣品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 （1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確量取各標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL于 50 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑配成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，冷藏避光保存。（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：分別按量量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白基質(zhì)液（V甲醇∶V水=2∶8）稀釋，得到系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，質(zhì)量濃度分別為 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，外標(biāo)法定量。

1.2.2 待測(cè)蔬菜樣品的前處理 （1）提取：將蔬菜可食部分用攪拌機(jī)打碎，取15.00 g（精確至0.01g）于100 mL聚四氟乙烯離心管中，加入30 mL乙腈，高速勻漿1 min；采用無(wú)水硫酸鈉和氯化鈉作為脫水劑，用量均為5 g，比較二者的脫水效果再確定最適脫水劑；繼續(xù)高速勻漿1 min，4 000 r/min高速離心4 min，取上清液待凈化。（2）凈化：比較了Carbon/NH2、NH2、C18氨基固相萃取柱對(duì)豇豆基質(zhì)的凈化效果，具體操作如下，用6.0 mL淋洗劑（V乙腈∶V甲苯

=3∶1）預(yù)淋洗，待固相萃取小柱平衡好后置于10 mL 雞心瓶上，加入1 mL提取液，當(dāng)提取液完全降至填料面時(shí)加入3 mL淋洗劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在4 0℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約0.2 mL，再轉(zhuǎn)為40℃氮?dú)獯蹈桑⒓从?.0 mL 甲醇溶液（V甲醇∶V水

=2∶8）溶解定容， 過(guò)0.22 μm濾膜，待HPLC- MS /MS測(cè)定。

1.2.3 HPLC 檢測(cè)條件 試驗(yàn)采用乙腈+水、甲醇+水和甲醇+水+10 mmol乙酸銨+1%甲酸水溶液3種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離，色譜柱為XBridgeBEH C18柱，試液定容溶劑為V甲醇︰V水=2︰8溶劑體系，進(jìn)樣體積5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜檢測(cè)條件 采用直接進(jìn)樣的方式手動(dòng)調(diào)節(jié)各質(zhì)譜參數(shù)。離子源為電噴霧離子（ESI）源，溫度120℃；毛細(xì)管電壓3.0 kV；去溶劑溫度350℃；去溶劑氣流量750 L/h；錐孔氣流速100 L/h；錐孔電壓30 V；采用MRM多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式；其余質(zhì)譜條件見(jiàn)

表1。

1.2.5 檢測(cè)方法的驗(yàn)證及蔬菜樣品的檢測(cè) 將質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)溶液進(jìn)樣分析，以各組分的進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x，μg/L） 和峰面積（Y） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在優(yōu)化的HPLC-MS/MS條件下，對(duì)38種農(nóng)藥的線性范圍、定量下線進(jìn)行檢測(cè)。并在豇豆和辣椒樣品中添加0.01和0.10 mg/kg的各種農(nóng)藥，上樣檢測(cè)，計(jì)算添加回收率（n=3），并驗(yàn)證檢測(cè)方法的精密度。采用試驗(yàn)建立的方法對(duì)蔬菜樣品進(jìn)行處理和檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取優(yōu)化

2.1.1 脫水劑 蔬菜含水量普遍偏高，38種農(nóng)藥中有多種水溶性強(qiáng)的農(nóng)藥。無(wú)水硫酸鈉通過(guò)與水結(jié)合的方式脫水，易受潮變性。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用無(wú)水硫酸鈉脫水，常出現(xiàn)甲胺磷和乙酰甲胺磷等水溶性強(qiáng)的農(nóng)藥回收率低、乙腈提取液脫水不完全、過(guò)氨基固相萃取柱堵塞等現(xiàn)象；而氯化鈉是以飽和溶解方式脫水，其作為脫水劑時(shí)不會(huì)出現(xiàn)上述現(xiàn)象。故最終選擇氯化鈉作為脫水劑。

2.1.2 凈化柱 直接往預(yù)淋洗好的固相萃取柱添加標(biāo)準(zhǔn)工作液，比較了Carbon/NH2、NH2、C18氨基固相萃取柱的對(duì)38種農(nóng)藥的濾過(guò)性，結(jié)果如圖1所示。雖然Carbon/NH2凈化效果最好，但對(duì)多種農(nóng)藥吸附較強(qiáng)，故最終確定采用C18氨基固相萃取柱作凈化柱，淋洗液為乙腈和甲苯的混合液（V乙腈∶V甲苯 =3∶1）。

2.2 流動(dòng)相優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果顯示，以甲醇為有機(jī)相時(shí)，各組分的信號(hào)強(qiáng)度比較穩(wěn)定；而以乙腈為有機(jī)相時(shí)信號(hào)明顯降低，且強(qiáng)極性農(nóng)藥如甲胺磷的保留時(shí)間過(guò)短，峰形較差；故甲醇為流動(dòng)有機(jī)相更合適。而在甲醇+水的流動(dòng)相中加入一定量的乙酸銨和甲酸等緩沖鹽各成分的分離效果更好。這是因?yàn)榧姿釋?duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的正離子化有增強(qiáng)效果，而乙酸銨對(duì)負(fù)離子化有增強(qiáng)效果，而且會(huì)明顯抑制部分農(nóng)藥的正離子化。多菌靈保留時(shí)間受pH值影響較大，pH值越小，保留時(shí)間越短。為確保38種農(nóng)藥在質(zhì)譜上都有較好的響應(yīng)，試驗(yàn)最終采用甲醇+水+10 mmol乙酸銨+1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行三元梯度洗脫分離，流動(dòng)相參數(shù)見(jiàn)表2。雖然降低了部分有較高正離子化的農(nóng)藥的響應(yīng)值，但確保了所有農(nóng)藥均有較好的離子化，同時(shí)保證了多菌靈等保留時(shí)間易受基質(zhì)pH值影響的農(nóng)藥的穩(wěn)定性。

2.3 方法的線性范圍與定量下限、回收率與精密度

如表3所示，在優(yōu)化的HPLC-MS/MS條件下，38種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.975～0.999。按照S/N≥10的標(biāo)準(zhǔn)，該方法對(duì)38種農(nóng)藥的最低檢測(cè)限均為0.002 mg/kg，滿足GB2763—2016中最大殘留限量要求。在豇豆和辣椒中分別添加0.01和0.10 mg/kg的各種農(nóng)藥，豇豆在0.01 mg/kg添加水平下的回收率為72.6%～119.6%，在0.10 mg/kg添加水平下的回收率為71.5%～119.4%；辣椒在0.01 mg/kg添加水平下的回收率為76.5%～118.2%，在0.10 mg/kg添加水平下的回收率為75.5%～119.2%；RSD均在10%以內(nèi)。

2.4 蔬菜樣品的檢測(cè)

從表4中可以看出，以結(jié)球白菜和萵筍為例，在1 kg結(jié)球白菜樣品中含吡蟲(chóng)啉0.1mg，符合GB/J2763的限量標(biāo)準(zhǔn)，屬于合格蔬菜；而1 kg萵筍樣品中檢出克百威含量為0.050 mg，超出了GB/J2763中規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)（0.02 mg），屬于農(nóng)殘超標(biāo)蔬菜。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)HPLC檢測(cè)器一般搭配UV檢測(cè)器或者FLR檢測(cè)器，檢測(cè)器流通量大，對(duì)流動(dòng)相流速兼容性高，因此一般HPLC使用直徑較大、填料顆粒粒徑加大的色譜柱。但是當(dāng)HPLC使用質(zhì)譜做檢測(cè)器時(shí)，由于離子源采用ESI源，最適液相流速不能高于0.8 mL/min。當(dāng)使用0.8 mL/min流速，在傳統(tǒng)液相色譜柱下，檢測(cè)各農(nóng)藥化合物峰底寬均超過(guò)1 min，且質(zhì)譜受高流速液相影響，離子化效率降低，儀器靈敏度降低。試驗(yàn)采用XBridgeBEH C18柱作色譜柱，在0.25 mL/min流速下，依然有較好的柱效和分析時(shí)間。但由于溶劑效應(yīng)，試液采用甲醇為溶劑時(shí)，極性強(qiáng)的農(nóng)藥（如甲胺磷、乙酰甲胺磷、涕滅威砜等）保留時(shí)間過(guò)短，峰形差，易受基質(zhì)干擾。為消除溶劑效應(yīng)，試驗(yàn)選擇甲醇和水作為定容溶劑體系，V甲醇︰V水=2︰8，進(jìn)樣體積從10 μL降至5 μL。

在選擇質(zhì)譜條件參數(shù)時(shí)，為了獲得最佳的靈敏度和分離效果，采用直接進(jìn)樣的方式 手動(dòng)調(diào)節(jié)各質(zhì)譜參數(shù)。結(jié)果顯示，大部分農(nóng)藥電噴霧離子化正離子掃描模式可得到較好的電離效果，并獲得特征離子峰[M+H]或[M+Na]，少部分為[M-H]。故在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步選擇質(zhì)譜參數(shù)合適的監(jiān)測(cè)離子錐孔電壓及碰撞能量。

研究從農(nóng)業(yè)部蔬菜農(nóng)藥殘留例行監(jiān)測(cè)參數(shù)出發(fā)，結(jié)合本地蔬菜生菜實(shí)際情況，選取了38種農(nóng)藥殘留做為研究對(duì)象，以豇豆和辣椒為試驗(yàn)樣本，采用高效液相串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）作為檢測(cè)設(shè)備，建立的較國(guó)標(biāo)方法（GB/T20769—2008）更為簡(jiǎn)便的前處理方法，精簡(jiǎn)了一次預(yù)濃縮操作，優(yōu)化了脫水劑的種類。試驗(yàn)結(jié)果證明該方法準(zhǔn)確可靠，能夠滿足蔬菜中多種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析。

參考文獻(xiàn)：

[1] GB/T20769—2008. 水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[2] NY/T1679—2009. 植物性食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[3] GB/T23205—2008. 茶葉中448種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[4] GB/T20770—2008. 糧谷中486種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[5] GB/T23206—2008. 果蔬汁、果酒中512種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[6] 王 敏. 固相萃取技術(shù)和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用在茶葉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[D]. 合肥：安徽大學(xué)，2013.

[7] 郭景春，李 娜，王建忠. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定8種蔬菜中114種農(nóng)藥殘留[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2014，（3）：279-288.

[8] 陳愛(ài)松，崔銀倉(cāng)，羌 松，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定哈密瓜和茄子中氟啶蟲(chóng)胺腈的殘留量[J]. 食品工業(yè)科技，2017，38（20）：260-265.

[9] Tian C Y，Xu J，Dong F，et al. Determination of sulfoxaflor in animal origin foods using dispersive solid—phase extraction and multiplug filtration cleanup method based on multiwalled carbon nanotubes by ultraperformance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2016，64（12）：2641-2646.

（責(zé)任編輯：成 平）