酶解法制備脫植醇葉綠素工藝研究

摘 要：通過(guò)單因素試驗(yàn)考察菠菜葉綠素酶酶解葉綠素的底物濃度、酶濃度、pH值、溫度等因素，再通過(guò)正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)的葉綠素酶解脫植醇工藝條件。結(jié)果表明，在葉綠素底物濃度為1.6 mmol/L、葉綠素酶濃度為50%原酶濃度、pH值為7.0、酶解溫度為35℃時(shí)有最大酶解速率。

關(guān)鍵詞：葉綠素；葉綠素酶；酶解速率

中圖分類號(hào)：Q71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）06-0084-04

Process Optimization of Hydrolyzing Chlorophyll to Remove Phytol by Enzymatic Hydrolysis

QIAO Ke-wei1，LI Shuai-fu1，YU Guo-liang1，ZHOU Xi-xin1，2，YANG Hua1

（1. College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC； 2. Science and Technology

Department， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract：The substrate concentration， enzyme concentration， pH， temperature and other factors of chlorophyll hydrolysis were investigated by single factor experiment. The optimum conditions of chlorophyll free enzyme and ethanol fermentation were obtained by orthogonal experiment. And then make sure the optimum conditions of chlorophyll free enzyme and ethanol fermentation were obtained by orthogonal experiment. The results showed that the maximum enzymolysis rate could be obtained when the concentration of chlorophyll substrate was 1.6 mmol/L， the concentration of chlorophyll enzyme was 50%， the pH was 7， and the enzymolysis temperature was 35℃.

Key words：chlorophyll； chlorophylase； enzymatic hydrolysis rate

葉綠素是一類植物色素，其主要作用是參與光合作用，是該過(guò)程中的一類主要作用基質(zhì)。光合作用作用于植物細(xì)胞葉綠體中，是植物通過(guò)合成含有化合能的有機(jī)化合物從而固定光能的過(guò)程[1]。葉綠素分布范圍廣泛，在所有以光合作用獲取能量的自養(yǎng)生物體內(nèi)都有存在，包括綠色植物、原核的藍(lán)綠藻（藍(lán)菌）和真核的藻類。諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Richard Willstatter和Hans Fisher研究發(fā)現(xiàn)：人體內(nèi)血紅蛋白分子與葉綠素的分子結(jié)構(gòu)較為相似[2]。但由于葉綠素存在葉綠醇（植醇）側(cè)鏈，水溶性不如血紅素。如果將葉綠素進(jìn)行改性，酶解脫去植醇，將鎂原子置換成亞鐵離子，葉綠素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)更類似血紅素，補(bǔ)血效果應(yīng)該更加明顯。在植物衰老和儲(chǔ)藏過(guò)程中，能產(chǎn)生葉綠素酶[3]。葉綠素酶作用底物為葉綠素，通過(guò)與葉綠素上特定結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，催化葉綠素中植醇酯鍵水解，從而產(chǎn)生脫植醇葉綠素，利用該酶可以達(dá)到脫植醇目的。由于H+易于進(jìn)入葉綠體與葉綠素結(jié)合，置換葉綠素中鎂離子，用含有大量H+的酸性物質(zhì)處理葉綠素，從而獲得去鎂葉綠素。去鎂葉綠素再與亞鐵離子結(jié)合，形成鐵代葉綠素[4-5]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 葉綠素購(gòu)自鄭州超凡化工有限公司。新鮮菠菜從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買。

1.1.2 主要試劑 丙酮，1，4-二氧六環(huán)，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，正己烷，Triton X-100。

1.1.3 主要器材 電子分析天平，上海卓精電子科技有限公司；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；HH-501S超級(jí)恒溫水浴鍋，上海赫田科技用品有限公司；H1650R高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JY-6.0 pH計(jì)，廣州佳儀精密儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菠菜葉葉綠素酶的提取 稱取適量新鮮無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)農(nóng)藥殘留、無(wú)蟲(chóng)卵菠菜葉，清洗干凈室溫下晾干，剪碎研磨致葉片呈糊狀，加入已4℃預(yù)冷24 h的丙酮，混合成勻漿，抽濾，對(duì)濾渣用4℃丙酮多次沖洗，直至濾渣呈無(wú)色。將濾渣在室溫環(huán)境通風(fēng)櫥中風(fēng)干獲得丙酮粉，將丙酮粉置于4℃環(huán)境下保存。取2 g前實(shí)驗(yàn)獲取的丙酮粉，加入pH值 7.0的20 mmol/L磷酸緩沖液50 mL，0℃冰浴30 min，在磁力攪拌器上中速攪拌5 min。取丙酮溶液于低溫冷凍離心機(jī)中，在4℃、8 000×g條件下離心20 min，用移液槍吸取上層清液進(jìn)行酶活性的測(cè)定[6]。

1.2.2 菠菜葉葉綠素酶活性的測(cè)定 構(gòu)建緩沖液體系：180 μL 20 mmol/L含0.24% Triton X-100磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至7.0。該體系在35℃水浴鍋中加熱，加入20 μL 1.0 mmol/L的葉綠素溶液、20 μL酶液。設(shè)置20 μL酶液和200 μL磷酸緩沖液的對(duì)照組。在兩組水浴反應(yīng)30 min后加入660 μL丙酮正己烷反應(yīng)終止劑，丙酮正己烷體積比為2∶3。對(duì)兩反應(yīng)組進(jìn)行低溫離心，以8 000×g速度離心10 min，取下層清液加入2.4 mL磷酸緩沖液和丙酮1∶1配置的稀釋液，搖勻，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定該體系在663 nm、645 nm吸光值。酶活定義：1 μmol葉綠素a在1 min水解所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U），每mg蛋白所含有的酶活性為比活，即U/mg。

1.2.3 酶液酶學(xué)性質(zhì)研究 （1）最適底物濃度的確定。設(shè)定葉綠素底物濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L，各20 μL，加入20 μL酶液，緩沖液180 μL，在35℃條件下水浴30 min測(cè)定條件如前，比較酶活力大小。（2）最適酶濃度的測(cè)定。取20 μL酶液，分別加蒸餾水稀釋濃度為原來(lái)的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。各取20 μL稀釋后的酶液，測(cè)定條件如前，比較酶活力大小。（3）最適反應(yīng)溫度的測(cè)定。取2.5 mL單位的EP管編號(hào)，加入由上述試驗(yàn)所測(cè)得濃度的葉綠素20 μL，最適濃度粗酶20 μL，加入180 μL磷酸氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液，分別置于30、35、40、45℃的水浴條件下反應(yīng)，水浴30 min取出，測(cè)定酶活力[7]。（4）最適反應(yīng)pH值的確定。對(duì)照工具書(shū)分別稱量磷酸氫鈉和磷酸氫二鈉，按比例混合調(diào)制成pH值為6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸緩沖液，用pH計(jì)測(cè)量并檢驗(yàn)緩沖液體系pH值。取20 μL酶液和20 μL最適濃度的底物，分別加入180 μL不同pH值磷酸緩沖液，在35℃條件下反應(yīng)30 min，測(cè)定酶活力，確定最佳緩沖液pH值。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)葉綠素酶酶解條件影響的4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素底物濃度對(duì)葉綠素酶活力的影響

葉綠素酶解脫速率與葉綠素底物濃度有關(guān)。在底物葉綠素濃度較低時(shí)，底物未與葉綠素酶完全結(jié)合，此時(shí)酶反應(yīng)速率受底物濃度制約，酶未發(fā)揮最大效力，隨著底物濃度的提高，反應(yīng)速率提高，此時(shí)反應(yīng)速率與葉綠素濃度的關(guān)系呈正比關(guān)系。當(dāng)葉綠素濃度達(dá)到一定時(shí)，反應(yīng)速率上升速率減弱，基本保持不變，此時(shí)葉綠素濃度為該酶酶促反應(yīng)最大時(shí)葉綠素濃度。因此，葉綠素酶催化葉綠素降解的反應(yīng)符合酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征[8]。

由圖1可知，底物濃度為1.6 mmol/L左右時(shí)葉綠素酶解脫速率達(dá)到最高值，由此可以看出最適宜葉綠素酶解脫底物濃度為1.6 mmol/L。在葉綠素濃度較低時(shí)，葉綠素酶未充分與底物結(jié)合，未發(fā)揮最大效益；當(dāng)葉綠素濃度較高時(shí)，葉綠素酶達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)，此時(shí)制約酶促反應(yīng)的因素是底物含量較少。

2.2 葉綠素酶濃度對(duì)解脫速率的影響

酶催化反應(yīng)速率與葉綠素酶濃度有關(guān)。在葉綠素酶酶液濃度較低時(shí)，底物葉綠素處于富余狀態(tài)，沒(méi)有足夠的底物與酶結(jié)合，此時(shí)酶促反應(yīng)速率與會(huì)隨著葉綠素酶濃度的增加而提高，與酶濃度呈正比關(guān)系；但隨著葉綠素酶濃度的增加，當(dāng)葉綠素酶濃度達(dá)到一定比例時(shí)，葉綠素酶與底物充分結(jié)合，反應(yīng)速率的增加不再遵循正比關(guān)系，反而基本保持不變。

由圖2可知，當(dāng)葉綠素酶濃度為原酶液濃度的50%時(shí)達(dá)到了最大酶促反應(yīng)速率。在葉綠素酶濃度較低時(shí)，葉綠素酶含量較少無(wú)法對(duì)底物完全反應(yīng)，達(dá)不到最大反應(yīng)速率；在葉綠素濃度較高時(shí)，葉綠素酶已經(jīng)達(dá)到了飽和狀態(tài)，此時(shí)再增加底物濃度是浪費(fèi)酶液。

2.3 不同pH值對(duì)解脫速率的影響

酶的活力受環(huán)境pH值的影響，不同酶所對(duì)應(yīng)的最適pH值不同。在特定的pH值下，酶可以表現(xiàn)出最大活力，在高于或低于該pH值環(huán)境下，外界因素會(huì)降低該酶活力。通過(guò)文獻(xiàn)了解到，酶對(duì)底物的作用機(jī)制主要為酶通過(guò)與底物上的特殊結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，降低反應(yīng)活化能，使結(jié)合體達(dá)到易分離狀態(tài)，進(jìn)而使底物分解。改變pH值會(huì)影響酶分子的空間構(gòu)象，進(jìn)而降低酶促反應(yīng)速率。

如圖3所示，在pH值為7.0時(shí)，達(dá)到了該酶促反應(yīng)的最適宜條件。當(dāng)環(huán)境pH值低于或是高于7.0時(shí)，酸堿度的變化影響了葉綠素酶的活性，使該酶的催化活力下降。因此，可以基本確定在pH值為7.0時(shí)酶反應(yīng)速率達(dá)到最大。

2.4 最適反應(yīng)溫度的確定

酶催化反應(yīng)速率與溫度有關(guān)，溫度的改變會(huì)影響酶活性的強(qiáng)弱。由圖4可知，在低溫條件下，溫度的升高會(huì)提高酶的活性，在35℃時(shí)，酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大。但環(huán)境溫度達(dá)到35℃以上時(shí)，隨著溫度的升高，葉綠素酶活力會(huì)逐漸降低。由于大部分酶由蛋白質(zhì)構(gòu)成，蛋白質(zhì)在高溫環(huán)境下會(huì)失活，從而影響蛋白質(zhì)性狀的表達(dá)。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測(cè)由于溫度的升高，酶蛋白逐漸失活，對(duì)葉綠素催化作用減弱，導(dǎo)致酶反應(yīng)速率下降。不同植物、不同部位、不同時(shí)期的酶的活力不同，受溫度影響也不同，最適酶促反應(yīng)溫度也不盡相同，但大部分植物的最適反應(yīng)溫度在20～50℃之間。

2.5 正交試驗(yàn)確定最適宜方案

對(duì)葉綠素濃度、葉綠素酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值4個(gè)因素選擇3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。由表2可知，對(duì)脫植醇的影響順序?yàn)椋篈>D>B>C，即葉綠素濃度>反應(yīng)pH值>葉綠素酶濃度>反應(yīng)溫度，最優(yōu)組合為A2B2C3D1，即葉綠素濃度1.6 mmol/L、葉綠素酶濃度為50%、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)pH值為6.5，葉綠素酶活力最大。

由于正交試驗(yàn)結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果不同，改變?cè)囼?yàn)反應(yīng)條件，進(jìn)行二次試驗(yàn)驗(yàn)證。取20 μL 50%濃度粗酶和20 μL 1.6 mmol/L濃度的底物加入到180 μL pH值7.0的緩沖體系中，在35℃下反應(yīng)，測(cè)定酶活。經(jīng)測(cè)定，在上述條件下，酶活力為0.004 27 U。大于在葉綠素濃度1.6 mmol/L、葉綠素酶濃度為50%、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)pH值6.5條件下的酶活力。綜上，最適反應(yīng)條件為葉綠素濃度1.6 mmol/L、葉綠素酶濃度為50%、反應(yīng)溫度35℃、反應(yīng)pH值為7.0。

經(jīng)由酶活力計(jì)算公式，計(jì)算可得，在上述最優(yōu)條件下，酶活力為0.004 27 U。

3 結(jié)論與討論

研究表明，最優(yōu)的葉綠素酶解脫植醇工藝條件為：葉綠素濃度1.6 mmol/L、葉綠素酶濃度為50%、反應(yīng)溫度35℃、反應(yīng)pH值為7.0。

研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素底物濃度的提高對(duì)解脫反應(yīng)速率的提高有一定促進(jìn)作用，但底物濃度達(dá)到一定程度時(shí)，酶液已經(jīng)基本飽和，酶利用率達(dá)到最大，此時(shí)增加底物濃度對(duì)于提高解脫反應(yīng)速率提高效果甚微。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)閱讀了解到，米氏常數(shù)Km值是反應(yīng)酶動(dòng)力學(xué)的重要特征性常數(shù)，對(duì)于了解該反應(yīng)途徑的酶活力最適底物濃度具有重要意義。但不同濃度系列的底物濃度對(duì)于Km值的測(cè)定有一定影響，在測(cè)定一種酶的Km值時(shí)僅選用了高濃度范圍，則無(wú)法觀測(cè)因多酶造成的結(jié)果偏離。試驗(yàn)注重解脫反應(yīng)的最大反應(yīng)速率，米氏常數(shù)為反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)的數(shù)值，依據(jù)對(duì)米氏常數(shù)的利用可以進(jìn)一步增大反應(yīng)速率[9]。

解脫速率與葉綠素酶濃度也有關(guān)，在底物濃度遠(yuǎn)大于酶濃度時(shí)，酶濃度的增加速率與酶促反應(yīng)的解脫速率呈正比關(guān)系，但這種情況建立在有純酶液或含酶量極高的組織提取液，通過(guò)對(duì)新鮮葉片的研磨提取無(wú)法達(dá)到較高酶量。在底物濃度固定的情況下，通過(guò)找尋最適宜酶濃度，在工業(yè)上可以降低成本，在實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中可以降低實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜程度，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。經(jīng)過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，在葉綠素酶濃度達(dá)到50%時(shí)，酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速率值，底物和酶已經(jīng)完全飽和，此時(shí)提高酶濃度對(duì)于提高酶活作用較小且浪費(fèi)物料。

酶反應(yīng)介質(zhì)的pH值會(huì)影響酶反應(yīng)速率的提高，這一影響主要作用在底物活性中心上的必需基團(tuán)的解離程度和催化基團(tuán)中質(zhì)子供體或質(zhì)子受體所需的離子化狀態(tài)，同時(shí)，pH值也會(huì)影響底物和輔酶的解離程度，在此基礎(chǔ)上影響底物和酶的結(jié)合，導(dǎo)致酶解速率降低。在pH值適宜的情況下，酶、輔酶和底物達(dá)到特定的解離狀態(tài)才能使他們相互結(jié)合，進(jìn)而達(dá)到酶解反應(yīng)的最大值，此時(shí)的環(huán)境pH值稱為該酶的最適pH值。在植物中，一般酶最適pH值在7.0左右，部分耐堿性植物中酶耐受pH值可以達(dá)到9。酶最適pH值是一種特定環(huán)境下的該酶活力最大的pH值，并非一成不變，而是受底物濃度、緩沖液的種類和濃度以及酶的純度、酶液中雜質(zhì)的種類等多方面的影響[10]。

酶活力也受溫度的影響，不同種類酶適宜溫度不同，在低溫條件下，溫度每升高10℃，酶的活力會(huì)提高1～2倍，但當(dāng)溫度較高時(shí)，高溫會(huì)使酶蛋白失活，從而導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率急劇下降。值得注意的是，高溫并不能使酶蛋白迅速失活，而是逐漸變性，在此基礎(chǔ)上，酶在變性過(guò)程中會(huì)進(jìn)行一部分酶促反應(yīng)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。低溫不會(huì)導(dǎo)致酶變性，低溫會(huì)抑制酶的活性，但溫度升高時(shí)酶會(huì)逐漸恢復(fù)活性。溫度不是酶的特征常數(shù)，酶促反應(yīng)的最適宜溫度會(huì)隨著pH值、底物濃度、酶的濃度以及輔酶濃度和性質(zhì)的改變而發(fā)生改變。最適溫度的確定需要多種條件的共同確定。

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（責(zé)任編輯：夏亞男）