逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1缺失片段植物表達(dá)載體構(gòu)建

摘 要：Mvnhx1啟動(dòng)子是一種與鹽脅迫和干旱脅迫相關(guān)的逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了更好地研究順式作用元件對(duì)Mvnhx1啟動(dòng)子功能特點(diǎn)的影響，研究根據(jù)啟動(dòng)子序列上與耐鹽和耐旱相關(guān)的順式作用元件分布位置不同設(shè)計(jì)引物，利用5'端缺失技術(shù)獲得11個(gè)不同長(zhǎng)度的Mvnhx1啟動(dòng)子缺失片段，分別構(gòu)建不同缺失片段與報(bào)告基因GUS融合的植物表達(dá)載體。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，成功克隆獲得11個(gè)長(zhǎng)度分別為1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp的片段。酶切鑒定顯示，成功構(gòu)建了由Mvnhx1啟動(dòng)子11個(gè)不同長(zhǎng)度缺失片段調(diào)控的帶GUS基因的植物表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；Mvnhx1；缺失片段；植物表達(dá)載體

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）06-0005-05

Construction of Adversity-induced Promoter Mvnhx1 Missing Fragment Plant

Expression Vector

REN Yan-ping，WANG Yi-hong，ZHU Shao-qing，WANG Ping

（College of Agronomy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， PRC）

Abstract： The Mvnhx1 promoter is an adversity-inducible promoter associated with salt stress and drought stress. In order to better study the effect of cis-acting elements on the functional characteristics of Mvnhx1 promoter， the primers were designed according to the distribution position of cis-acting elements related to salt tolerance and drought tolerance in the promoter sequence， and the results were obtained by 5' Eleven different length of the Mvnhx1 promoter fragment were fragmented to construct a plant expression vector with different deletion fragments and the reporter gene GUS. The results of PCR amplification showed that 11 fragments were 1 135 bp， 1 027 bp， 974 bp， 967 bp， 858 bp， 727 bp， 726 bp， 564 bp， 366 bp， 352 bp and 210 bp， respectively. The results of restriction enzyme digestion showed that the plant expression vector of GUS gene regulated by 11 different deletions of Mvnhx1 promoter was successfully constructed.

Key words： inducible promoter； Mvnhx1； deletion fragment； plant expression vector

啟動(dòng)子是位于基因上游區(qū)域調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，是一種重要的順式調(diào)控因子，決定基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)空精確性和轉(zhuǎn)錄效率，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)[1]。按照基因的表達(dá)方式，啟動(dòng)子分為組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型[2]。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在特定的誘導(dǎo)因素下驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，但是有些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也具有組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)[3]。這種類型的啟動(dòng)子多以誘導(dǎo)信號(hào)的類型命名[4]。如干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、赤霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等。

鑒于組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)不具備時(shí)間和組織特異性，往往使植物體內(nèi)積累過量外源基因表達(dá)產(chǎn)物，導(dǎo)致植物表型、代謝受到嚴(yán)重影響。因此對(duì)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。

研究表明，Mvnhx1啟動(dòng)子是一種與鹽脅迫和干旱脅迫相關(guān)的逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了更好地研究逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1各個(gè)元件響應(yīng)脅迫的特點(diǎn)，研究以逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1為材料，根據(jù)該啟動(dòng)子上不同順式作用元件位置和數(shù)量特點(diǎn)，利用5’缺失突變技術(shù)來獲得含有不同順式作用元件的逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1缺失片段，并構(gòu)建含有報(bào)告基因GUS的植物表達(dá)載體[5]，為Mvnhx1啟動(dòng)子缺失片段功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

pCAMBIA1304-Mvnhx1重組質(zhì)粒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1上與逆境相關(guān)的順式作用元件分布位置，利用5'端缺失技術(shù)及引物設(shè)計(jì)原則，將逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1分為11個(gè)不同長(zhǎng)度的缺失片段，上游引物分別為nqs1～nqs11（含SacI酶切位點(diǎn)），下游引物為nqs12（含NcoI酶切位點(diǎn)）。以重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-Mvnhx1為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)[6]。引物組合分別為nqs1+nqs12、nqs2+nqs12、nqs3+nqs12、nqs4+nqs12、nqs5+nqs12、nqs6+nqs12、nqs7+nqs12、nqs8+nqs12、nqs9+nqs12、nqs10+nqs12、nqs11+nqs12，產(chǎn)物分別命名為TNQS1～TNQS11。

1.2.2 Mvnhx1缺失片段與T載體連接 將擴(kuò)增得到的目的片段切膠回收[7]，依次加入不同試劑，短暫離心5 s，25℃反應(yīng)15 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 取大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞加入上述連接產(chǎn)物中，用移液槍輕輕吸打使其混勻，冰浴30 min；使用PCR儀42℃熱激90 s，冰浴2 min；將上述溶液轉(zhuǎn)移至含有800 μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)50 min；2 000 r/min離心1 min，棄去上清液，保留200 μL菌液，涂于含有氨芐青霉素（工作濃度為50 μg/L）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃環(huán)境正置培養(yǎng)30 min，待培養(yǎng)基表面溶液被吸收后，倒置培養(yǎng)12～16 h[8]。

1.2.4 重組質(zhì)粒篩選鑒定 在過夜培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，挑選5個(gè)單菌落接種于含有氨芐青霉素（工作濃度為50 μg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min培養(yǎng)12～16 h。編號(hào)為TNQSn-1～TNQSn-5，其中n為1～11。依次進(jìn)行菌液PCR鑒定、重組質(zhì)粒DNA提取鑒定、單雙酶切鑒定，最終進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.2.5 表達(dá)載體的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒TNQS1～TNQS11分別用SacI和NcoI雙酶切[9]，短暫離心30 s，37 ℃反應(yīng)4 h。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，回收目的片段。將重組質(zhì)粒pCAMBIA1304用SacI和NcoI雙酶切，短暫離心30 s，37 ℃反應(yīng)4 h。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段pCAMBIA1304大片段進(jìn)行連接，16℃連接25 h，然后將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化、搖菌、提質(zhì)粒、酶切鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mvnhx1缺失片段的獲得

2.1.1 缺失片段的確定 根據(jù)逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1序列上與逆境相關(guān)的順式作用元件分布位置不同，以及引物設(shè)計(jì)原則，確定引物位置，如圖1所示。

2.1.2 Mvnhx1缺失片段PCR擴(kuò)增結(jié)果 以重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-Mvnhx1為模板，PCR擴(kuò)增獲得不同長(zhǎng)度的Mvnhx1缺失片段。如圖2所示，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期值一致，缺失片段TNQS1～TNQS11大小依次為1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp。

2.1.3 Mvnhx1缺失片段膠回收產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果 切膠回收目的片段，取10 μL用于電泳檢測(cè)。由圖3可知，已回收到單一的目的條帶，可用于連接反應(yīng)。

2.1.4 重組質(zhì)粒菌液PCR電泳檢測(cè)結(jié)果 使用引物nqs1+nqs12、nqs2+nqs12、nqs3+nqs12、nqs4+nqs12、nqs5+nqs12、nqs6+nqs12、nqs7+nqs12、nqs8+nqs12、nqs9+nqs12、nqs10+nqs12、nqs11+nqs12分別對(duì)重組質(zhì)粒TNQS1-TNQS11進(jìn)行PCR檢測(cè)，可以清楚地的得到與預(yù)期值一致的擴(kuò)增片段（圖4），大小依次為1 135、

1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp。

2.1.5 重組質(zhì)粒電泳檢測(cè)結(jié)果 對(duì)菌液PCR陽(yáng)性菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，質(zhì)粒大小與預(yù)期值一致，大小依次為3 827、3 719、3 666、3 659、3 550、3 419、3 418、

3 256、3 058、3 044和4 039 bp。為了進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒的正確性，將初步驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明已獲得正確的Mvnhx1缺失片段TNQS1～TNQS11重組質(zhì)粒。

2.2 Mvnhx1缺失片段植物表達(dá)載體構(gòu)建

2.2.1 Mvnhx1缺失片段雙酶切目的片段的獲得 使用SacI和NcoI分別雙酶切TNQS1～TNQS11重組質(zhì)粒，可依次切出1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp左右目的片段（圖6）。切膠回收目的片段，用于植物表達(dá)載體構(gòu)建。

2.2.2 pCAMBIA1304雙酶切載體片段的獲得 使用SacI和NcoI雙酶切pCAMBIA1304重組質(zhì)粒，可切出11 559 bp左右目的片段（圖7）。切膠回收目的片段，用于植物表達(dá)載體構(gòu)建。

2.2.3 Mvnhx1缺失片段植物表達(dá)載體菌液PCR電泳檢測(cè) 利用DNA連接酶，將所回收的片段連接，從而構(gòu)建出含有Mvnhx1啟動(dòng)子各缺失片段和報(bào)告基因GUS的植物表達(dá)載體。將連接好的植物表達(dá)載體分別命名為pQS1～pQS11。菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果大小分別為1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp，與預(yù)期片段大小一致（圖8）。

2.2.4 Mvnhx1缺失片段植物表達(dá)載體質(zhì)粒電泳檢測(cè) Mvnhx1缺失片段植物表達(dá)載體pQS1～pQS11菌液PCR陽(yáng)性菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，質(zhì)粒片段大小分別為12 694、12 586、12 533、12 526、12 417、12 286、12 285、

12 123、11 925、11 911和11 769 bp，與預(yù)期值一致（圖9）。

2.2.5 Mvnhx1缺失片段植物表達(dá)載體雙酶切檢測(cè) 使用SacI和NcoI分別雙酶切pQS1～pQS11重組質(zhì)粒，均可分別切出1 135、1 027、974、967、858、727、726、564、366、352和210 bp左右目的片段，與預(yù)期值一致（圖10），初步證明pQS1～pQS11重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。為了進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒的正確性，將初步驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明已獲得正確的pQS1～pQS11重組質(zhì)粒。

3 討 論

啟動(dòng)子功能分析方法包括生物信息學(xué)分析法和實(shí)驗(yàn)分析法。生物信息學(xué)分析法主要依托數(shù)據(jù)庫(kù)初步預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列，分析啟動(dòng)子序列上包含的調(diào)控元件，為進(jìn)一步確定啟動(dòng)子功能奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)分析法包括點(diǎn)突變分析、凝膠阻滯分析、瞬時(shí)表達(dá)分析、轉(zhuǎn)化分析和酵母單雜交分析，其中，點(diǎn)突變分析已成為現(xiàn)在最常用的研究啟動(dòng)子功能的方法[10]。

前期研究結(jié)果顯示，Mvnhx1啟動(dòng)子是一種與鹽脅

迫和干旱脅迫相關(guān)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了研究逆境誘

導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1各元件響應(yīng)脅迫的特點(diǎn)，研究以逆

境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1為材料，根據(jù)該啟動(dòng)子上不

同順式作用元件位置和數(shù)量特點(diǎn)，利用5'缺失突變技

術(shù)來獲得含有不同順式作用元件的逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

Mvnhx1缺失片段，并成功構(gòu)建含有GUS報(bào)告基因[11-12]

的植物表達(dá)載體：Mvnhx1qs1∷Gus、Mvnhx1qs2∷

Gus、Mvnhx1qs3∷Gus、Mvnhx1qs4∷Gus、Mvnhx1qs5∷

Gus、Mvnhx1qs6∷Gus、Mvnhx1qs7∷Gus、Mvnhx1qs8∷

Gus、Mvnhx1qs9∷Gus、Mvnhx1qs10∷Gus、Mvnhx1qs11∷

Gus，為后續(xù)逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Mvnhx1不同元件的作用研究打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：成 平）