大鼠亞急性酒精性肝損傷模型的建立*

柴瑋杰 孫建飛 王明秋 高珉之 孟 琳

(黑龍江省疾病預防控制中心，哈爾濱 150030)

肝臟是人類基本代謝和酒精代謝的主要器官,超過95%的酒精是在肝臟中完成代謝的。酒精性肝病是慢性酒精中毒最常見和最嚴重的并發(fā)癥, 而對酒精性肝病發(fā)病機制、病理學改變、預防和治療酒精性肝病的有效藥物篩選及其作用機制等相關(guān)研究則需要通過動物實驗來實現(xiàn)，所以建立一個與人類酒精性肝病相似的動物病理實驗模型非常必要。

1 材料與方法

1.1 動物來源

SPF級雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量150～180 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(許可證號：SCXK(京)2012-0001)。

1.2 飼養(yǎng)環(huán)境

屏障環(huán)境，許可證號：SYXK(黑)2011-014，溫度(23±2)℃，濕度(55±10)%。光照周期為12 h:12 h(光照起止時間為6:00-18:00)。飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號SCXK(京)2014-0010。水和飼料自由飲食。

1.3 主要實驗儀器和試劑

1.3.1主要實驗儀器：動物天平、分析天平、日立7080全自動生化分析儀、722型分光光度計、恒溫水浴鍋、離心機、組織勻漿器、病理制片儀器(所有計量儀器經(jīng)黑龍江省計量檢定測試所檢測合格)。

1.3.2主要試劑：乙醇脫氫酶(ADH)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒由南京建成生物工程研究所提供，血清生化分析試劑盒由中生北控生物科技股份有限公司提供。甲醛，伊紅，戊巴比妥鈉。

1.4 方法

SPF級雌性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量150～180 g，隨機分為3組，每組10只，分別為15%酒精含量組、30%酒精含量組和空白對照組(蒸餾水)，試驗周期為8周。各組動物均采用經(jīng)口灌胃方法，以15 mL/kg·BW連續(xù)灌胃8周。實驗結(jié)束時，動物禁食不禁水16 h，從大鼠眼眶靜脈叢采血，測定血清中ADH、ALT、AST；并取肝臟，測定肝臟組織MDA、SOD、GSH、TG及肝臟組織病理學損傷。

1.5 統(tǒng)計方法

應用Stata8.0統(tǒng)計軟件對各試驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 日常觀察結(jié)果

空白對照組大鼠毛發(fā)亮澤，動作靈活，飲食和大便正常，無死亡；模型組大鼠在灌胃初期均有精神萎靡，呆滯等現(xiàn)象，一般經(jīng)過4 h后開始蘇醒，16 h后完全清醒，并變現(xiàn)為毛發(fā)光澤性差。

2.2 酒精性肝損傷大鼠肝組織中MDA、GSH、TG含量及SOD的活力

由表1可見，MDA 30%酒精組與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；GSH 30%酒精組、15%酒精組與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01，P<0.01)；SOD 30%酒精組、15%酒精組與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01，P<0.01)；TG 30%酒精組與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。

2.3 酒精性肝損傷大鼠血清中ADH、ALT、AST含量

由表2可見，ADH 30%酒精組、15%酒精組與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)； 30%酒精組大鼠血清ALT顯著升高(P<0.01)；各組血清AST無顯著變化(P>0.05)。

表1 酒精性肝損傷對大鼠肝組織中MDA、GSH、SOD、TG的影響

注：*與空白對照組比較，有顯著性差異P<0.05，**與空白對照組比較，有顯著性差異P<0.01 Note:*P<0.05 compared with control group,**P<0.01 compared with control group

表2 酒精性肝損傷大鼠血清中ADH、ALT、AST的含量

注：*表示試驗組與空白對照組比較P<0.05，**表示試驗組與空白對照組比較P<0.01 Note:*P<0.05 compared with control group,**P<0.01 compared with control group

2.4 對大鼠肝組織病理的影響

模型組大鼠血脂代謝紊亂、肝內(nèi)脂肪蓄積，病理組織學檢查可見彌漫性的肝細胞脂肪變性，細胞內(nèi)可見大小不等的脂肪滴(見圖1、圖3)，空白對照組肝細胞(見圖2、圖4)。由表3可見：15%酒精組、30%酒精組肝組織脂肪變性程度與空白對照組比較，有顯著性差異(P<0.01，P<0.01)。

圖1 肝細胞脂肪變性(HE ×200)

圖2 空白對照組肝細胞(HE ×200)

圖3 肝細胞脂肪變性(蘇丹Ⅲ ×200)

圖4 空白對照組肝細胞(蘇丹Ⅲ ×200)

表3 酒精性肝損傷大鼠肝組織的病理變化

注：**表示試驗組與空白對照組比較P<0.01 Note:**P<0.01 compared with control group

3 討論

酒精是導致人類肝損傷的重要原因，必須建立動物模型來研究酒精性肝損傷的發(fā)病機制，以尋求防治措施。酒精灌胃模型在國內(nèi)廣泛使用，張旭強等[1]先用40%的白酒灌胃1周后，每周提高5%酒精濃度灌胃，第4周后以56度白酒灌胃。前4周灌酒的劑量為1.0 mL/100 g體質(zhì)量，后4周灌酒計量為1.2 mL /100 g，每天灌胃1次，造模12周。結(jié)果顯示模型組大鼠血清中ALT、AST水平明顯升高與正常組比較有顯著性差異。周寧等[2]按大鼠體質(zhì)量灌胃56度的白酒7 g/kg，每日1次，實驗周期24周。結(jié)果顯示模型組大鼠肝臟病理改變?yōu)橹靖魏透渭毎装Y同時存在，隨著造模時間的延長肝臟病變加深。國內(nèi)有科學工作者采用以下方法對大鼠進行酒精灌胃飼養(yǎng)：即隨著飼養(yǎng)時間的延長而不斷加大酒精劑量，具體方法是：1～4周的酒精飼養(yǎng)劑量為5 g/kg·d-1；5～8周劑量為7 g/kg·d-1；9～12周劑量為9 g/kg·d-1；13～24周劑量為9.5 g/kg·d-1[3]。通過這種遞增式的高濃度長時間酒精灌胃，比較容易誘導急性肝損傷，同時可以誘導較為嚴重的酒精性肝纖維化[4]。我們在預實驗中曾設(shè)45%酒精對照組，但4周時死亡一半，所以正式試驗我們?nèi)∠@一劑量組。本實驗選用SPF級雌性Wistar大鼠，模型組分別以酒精含量為15%、30%的普通白酒，對照組給予蒸餾水，以15 mL/kg·BW經(jīng)口灌胃方式給予,于實驗第8周將模型組與正常組比較，結(jié)果顯示，酒精濃度15%損傷不明顯， 30%造模結(jié)果比較理想。模型組肝臟組織MDA、TG含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，SOD、GSH含量顯著性降低(P<0.01)。模型組大鼠血脂代謝紊亂、肝內(nèi)脂肪蓄積，血清ALT、ADH指標明顯升高，模型組與正常組比較相關(guān)指標均有顯著性差異；從肝臟病變得分來看，模型組病變總分值明顯增加且具有統(tǒng)計學意義，酒精性肝損傷模型是以肝組織病理改變?yōu)橹饕卣?，如肝細胞空泡變性[5]，我們的結(jié)果也如此。由此可見，大鼠經(jīng)口灌胃給予30%的普通白酒8周，可致肝損傷，結(jié)果可重復，成功建立大鼠亞急性酒精性肝損傷的動物模型。

性別的差異也是導致酒精性肝病的重要因素,與男性相比,女性對酒精所誘發(fā)的肝臟毒性效應更加敏感。臨床上常用血清學指標反映肝細胞損傷程度，ALT, AST,均為臨床上最常使用的判斷肝功能的血清學指標[6-8]。其中ALT只存在于肝細胞質(zhì)中,而AST在肝細胞質(zhì)內(nèi)只占20%,其余80%存在于線粒體中。當肝細胞變性、細胞膜通透性增加時,從細胞內(nèi)逸出的主要是ALT,而當肝細胞嚴重病變、壞死時,線粒體內(nèi)AST滲漏入血。本次造模采用低度酒，給予8周，結(jié)果顯示,模型組大鼠血清ALT活性均較空白對照組明顯增高,表明長期過量飲酒己對大鼠肝臟細胞結(jié)構(gòu)和功能構(gòu)成損傷,結(jié)果與空白對照組比較差異顯著，但還沒有造成特別嚴重損害。研究認為乙醇脫氫酶在酒精性肝病發(fā)生和發(fā)展中起著不可替代的作用。酒精在肝細胞中有3種主要的代謝途徑，依次為ADH途徑、MEOS、過氧化物酶途徑。乙醇脫氫酶(ADH)是乙醇在體內(nèi)代謝的重要酶類之一，體內(nèi)乙醇脫氫酶主要在肝臟生成，所以肝臟疾患與乙醇脫氫酶活性相關(guān)。測定乙醇脫氫酶活性可以反映肝臟受損情況。與空白對照組比較，模型組大鼠血清ADH活性明顯增強(P< 0.05)，表明長期過量飲酒可對大鼠肝臟造成嚴重損傷；提示持續(xù)攝入乙醇可誘導肝臟ADH活性增高，乙醛生成量增加，加重肝臟損傷；證實亞急性酒精中毒大鼠肝臟損傷模型建立成功。

為進一步研究慢性酒精中毒引起大鼠肝損傷機理,本項研究從抗氧化角度,選擇MDA、SOD和GSH作為效果觀察指標。谷胱甘肽(GSH)是一種低分子清除劑，缺乏或耗竭GSH會促使許多化學物質(zhì)或環(huán)境因素產(chǎn)生中毒作用或加重其中毒作用，這可能與增加氧化損傷有關(guān)，因而GSH量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。乙醇代謝產(chǎn)物乙醛也可通過黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基,其本身還能與GSH的巰基及抗氧化蛋白酶結(jié)合,肝臟細胞內(nèi)GSH含量減少或消耗，抗氧化酶活性下降，肝臟內(nèi)源性抗氧化能力減弱[9]。測試丙二醛(MDA)的量常?？煞磻獧C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反應出細胞損傷的程度。 MDA是自由基損傷不飽和脂肪酸生成的脂類過氧化分解產(chǎn)物,其含量的升高也可以間接證明自由基水平升高及反映機體受活性氧損傷的程度；超氧化物歧化酶(SOD)對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基(O2·-)保護細胞免受損傷。SOD是一種存在于細胞液中的抗氧化酶,可清除超氧陰離子自由基(O2·-),保護組織細胞免受超氧陰離子的損傷,在平衡機體的氧化與抗氧化關(guān)系中起至關(guān)重要的作用,SOD活性的高低可間接反映機體抗氧化能力的強弱；此外，長期過量攝入酒精會使自由基生成增加，進一步促進脂質(zhì)過氧化反應，使血清轉(zhuǎn)氨酶升高、終產(chǎn)物MDA生成增加，消耗GSH,生成大量過氧化脂質(zhì)，抑制抗氧化系統(tǒng)的保護作用，使體內(nèi)氧化-抗氧化機制失衡，引起肝臟損傷。

本項研究結(jié)果顯示,模型組大鼠的肝組織SOD活性及GSH含量較正常組明顯降低,而MDA含量則明顯增高。提示持續(xù)過量的酒精在大鼠肝臟代謝過程中不斷產(chǎn)生的自由基己經(jīng)造成GSH耗竭,SOD酶活性由代償性增加至失代償下降及抗氧化酶的合成減少[10]。證實亞急性酒精中毒大鼠體內(nèi)氧化應激作用增強,抗氧化能力減弱是導致肝臟損傷的主要原因。此結(jié)果與乙醇致肝臟損傷發(fā)生機理的相關(guān)研究報道一致。