長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群體生物學(xué)特性的初步研究*

馬蘭芝 杜小燕 尚世臣 崔曉霞 李 迎,3 黃 斌 尚玉璞 李桂軍 王冬平 陳振文

(1.軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心， 北京 100071)(2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)(3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

長爪沙鼠在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為實驗動物應(yīng)用研究已有60余年的歷史。其獨特的解剖學(xué)、生理學(xué)和行為學(xué)特征對于特殊研究項目具有重要價值，尤其沙鼠固有的特征，繁殖的沙鼠腎上腺皮質(zhì)固醇(主要是糖皮質(zhì)固醇)分泌亢進(jìn)，同時伴有高血糖癥等備受重視[1]。Boquist在長爪沙鼠群中發(fā)現(xiàn)了部分(37.14%)肥胖并且伴有空腹血糖升高和糖耐量下降的個體，Vincent發(fā)現(xiàn)在常規(guī)飼養(yǎng)狀態(tài)下出現(xiàn)肥胖的長爪沙鼠群體中，部分個體表現(xiàn)出糖耐量受損、血清胰島素有免疫反應(yīng)和胰腺等多臟器出現(xiàn)糖尿病特征[2]。首都醫(yī)科大學(xué)以空腹血糖和OGTT2h血糖值為篩選指標(biāo)，進(jìn)行近交選育繁殖。目前已經(jīng)到達(dá)F20代，本研究針對F20～F21代長爪沙鼠的血液生理生化、遺傳生化位點標(biāo)記和生長繁殖特性等進(jìn)行初步探討，為長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群體的生物學(xué)特性研究和數(shù)據(jù)庫提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為其特性和應(yīng)用研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群F20～21代動物，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SYXK(京)-2013-0005]，實驗動物自由采食和飲水，室溫為20～24 ℃。本實驗通過首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物和動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(No.AEEI-2017-032)

1.2 儀器設(shè)備及主要試劑

生化數(shù)據(jù)使用Beckman全自動生化分析儀(CX5 PRO)及其配套試劑，為Beckman公司提供生產(chǎn)的；血細(xì)胞計數(shù)使用日本光電全自動血細(xì)胞分析儀(MEK-7222 K)及其配套試劑，為上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司生產(chǎn)；離心使用日本HITACHI公司低溫離心機(jī)(CF16RX)；DYY-Ⅲ-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYY-Ⅲ-38B電泳槽；DYY-Ⅰ玻璃組織勻漿機(jī)；脫色搖床(GFL3018)；超級加樣器(WD-9404)，醋酸纖維板購于北京六一儀器廠；染色試劑均來自于美國Sigma公司，常規(guī)生化試劑為分析純；大小鼠的標(biāo)準(zhǔn)品購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 方法

1.3.1血液標(biāo)本采集和處理： 實驗前動物空腹12～24 h，自由飲水。眼眶靜脈取抗凝血(1%的肝素)和全血， 全血靜止 30 min，5 000 r/min離心10 min 制備血清備用?？鼓獪y定血細(xì)胞之后，5 000 r/min 離心10 min 制備血漿，血細(xì)胞加入蒸餾水(1∶0.5)，震蕩制備溶血素。動物頸椎脫臼處死，剖腹取心臟、肺臟、腎臟、胰腺、睪丸，放入5 mL EP管中，按1∶1的比例添加蒸餾水，用組織勻漿機(jī)研磨，置于低溫高速離心機(jī)10 000 r/min離心60 min，吸取上清液備用, -20 ℃冰箱保存。

1.3.2測定指標(biāo)： 血液生化指標(biāo)17項：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(URIC)、總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、淀粉酶(AMY)、鎂(Mg)以及葡萄糖(GLU)。血細(xì)胞指標(biāo)22項：白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、單核細(xì)胞(MON)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(BAS)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、單核細(xì)胞百分比(MON%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS%)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(BAS%)、紅細(xì)胞(RBC)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)、血紅蛋白(HGB)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、血小板(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板平均體積(MPV)、血小板體積分布寬度(PDW)。遺傳生化位點標(biāo)記26個：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-1(Gpd-1)、酯酶-3(Es-3)、碳酸酐酶-2(Car-2)、堿性磷酸酶-1(Akp-1)、異檸檬酸脫氫酶-1(Idh-1)、蘋果酸酶-1(Mod-1)、磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)位酶-1(Pgm-1)、腎過氧化氫酶-2(Ce-2)、肽酶-3(Pep-3)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶-1(Gpi-1)、血紅蛋白-β鏈(Hbb)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf)、酯酶-1(Es-1)、酯酶-10(Es-10)、甘油磷酸脫氫酶-1(Gdc-1)、β-葡萄糖苷酸酶-1(Gus-1)、酯酶-2(Es-2)、乳酸脫氫酶調(diào)節(jié)體-1(Ldr-1)、血清蛋白-1(Sep-1)、淀粉酶-1(Amy-1)、酯酶-6(Es-6)、酯酶-8(Es-8)、酯酶-9(Es-9)、酯酶-4(Es-4)、過氧化氫酶-1(Cs-1)、酯酶-12(Es-12)。

1.3.3繁殖特性：采用F20-21代成年長爪沙鼠9對，按照近交系動物生產(chǎn)繁殖原理，取一雌一雄長期同居交配方式繁殖飼養(yǎng)。在記錄卡片上記錄交配日期，出生日期，產(chǎn)仔數(shù)，死亡數(shù)，離乳仔鼠數(shù)，離乳仔鼠體質(zhì)量，統(tǒng)計初產(chǎn)日齡，產(chǎn)仔胎數(shù)等繁殖信息。

1.3.4生長發(fā)育觀察：自出生之日起逐日進(jìn)行觀察，記錄初生體質(zhì)量，第一周，每天稱量仔鼠體質(zhì)量，以后每周稱量體質(zhì)量至第八周。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，使用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析對測得的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 血液生化測試結(jié)果

應(yīng)用3～4月齡糖尿病近交系長爪沙鼠雌性7只和雄性14只測得血液生化指標(biāo)17項，統(tǒng)計結(jié)果顯示：長爪沙鼠糖尿病近交系雌雄之間生化指標(biāo)ALP、HDL-C、CRE差異極顯著(P<0.01)；GLU、TG、LDH、差異顯著(P<0.05)，其它指標(biāo)差異不顯著(見表1)。

表1 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群血液生化指標(biāo)雌雄之間的比較

注：**雌雄比較差異極顯著，P<0.01；*雌雄比較差異顯著，P<0.05 Note:**the male and female comparison difference was very significant,P<0.01;*the male and female comparison difference was significant,P<0.05

2.2 血液生理指標(biāo)測試結(jié)果

應(yīng)用3～4月齡長爪沙鼠糖尿病近交系雌性7只和雄性14只測得血液生理指標(biāo)22項，統(tǒng)計結(jié)果顯示：長爪沙鼠糖尿病近交系血液生理指標(biāo)雌雄之間比較MCV、MCH、EOS差異顯著P<0.05，其它指標(biāo)差異不顯著(見表2)。

表2 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群血液生理指標(biāo)雌雄之間的比較

注：*雌雄比較差異顯著，P<0.05 Note:*the difference between male and female was significant,P<0.05

2.3 糖尿病近交系長爪沙鼠生化基因位點遺傳質(zhì)量分析

應(yīng)用已經(jīng)建立的方法[3]檢測長爪沙鼠糖尿病近交系培育群遺傳生化位點標(biāo)記26項，20只動物檢測結(jié)果顯示26個生化位點標(biāo)記呈現(xiàn)單一性(見表3)。

2.4 繁殖性能

2.4.11～5胎窩產(chǎn)仔數(shù)、初生窩重和初生仔鼠平均重的比較

9對繁殖種鼠統(tǒng)計結(jié)果：長爪沙鼠糖尿病近交系1～5胎的出生數(shù)、初生窩重和初生平均重量差異不顯著(見表4)。

表3 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群遺傳生化位點標(biāo)記(n=20)

表4 1～5胎窩產(chǎn)仔數(shù)、初生窩重和初生仔鼠平均重的比較

2.4.2離乳均重、成年體質(zhì)量和離乳成活率

離乳動物的體質(zhì)量及離乳成活率、8周齡的成年體質(zhì)量進(jìn)行測試和統(tǒng)計，其結(jié)果如下(見表5).

表5 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群的成年體質(zhì)量和離乳均重及成活率

2.4.3繁殖群體不同的胎間隔比較

選取近交F20代的種鼠9對進(jìn)行交配繁殖，進(jìn)行胎間隔的觀察統(tǒng)計，胎間隔在20～157 d之間，胎間隔2和3的標(biāo)準(zhǔn)差較大，說明在繁殖第3、4、5胎的胎間隔差異很大(見表6)。

表6 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群繁殖的胎間隔

2.5 生長曲線

長爪沙鼠糖尿病模型近交系1～7 d的生長曲線：R=0.9887，決定度R2=0.9776，在該段時間內(nèi)影響體質(zhì)量增加的因素中日齡起了97.76%的作用；長爪沙鼠糖尿病模型近交系1～8周的生長曲線：R=0.9921，決定度R2=0.9842，在該段時間內(nèi)影響體質(zhì)量增加的因素中周齡起了98.4%的作用,(見圖1)。

圖1 長爪沙鼠糖尿病模型近交系動物的生長曲線

3 討論

長爪沙鼠糖尿病模型近交系是在進(jìn)行長爪沙鼠近交系培育過程中，發(fā)現(xiàn)一個分支的動物有空腹血糖較高的現(xiàn)象，經(jīng)過對糖尿病相關(guān)指標(biāo)篩查、選種進(jìn)行兄妹交配培育而育成的，目前已經(jīng)達(dá)到F20代。本研究對長爪沙鼠糖尿病模型近交系的遺傳生化位點標(biāo)記和部分生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，這些特性為長爪沙鼠糖尿病模型近交系進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化、鑒定和應(yīng)用提供依據(jù)。

實驗動物血液生化和生理參數(shù)主要是受到動物自身遺傳因素的控制，并且受諸多因素的影響[4 ]。正常的血液生理生化指標(biāo)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中是重要的指標(biāo), 是病理學(xué)、毒理學(xué)等研究的重要參考依據(jù)[5]。本研究測得血液生理生化結(jié)果：長爪沙鼠糖尿病模型近交系雌雄之間生化指標(biāo)ALP、HDL-C、CRE差異極顯著(P<0.01)；GLU、TG、LDH、MCV、MCH、EOS差異顯著(P<0.05)。GLU值均高于5.0，雄性比雌性的高。文獻(xiàn)報道[6]的CMU/1近交系長爪沙鼠雌雄之間GLU、CRE、PLT、MPV、BAS、LYM%差異顯著，CMU/1近交系長爪沙鼠雌雄之間TG、PDW差異極顯著，CMU/2近交系長爪沙鼠雌雄之間CHOL、HCT、MCV、MCH差異顯著，與本文結(jié)果一致。

近交系動物基本的特征是遺傳基因高度純合、表型一致，實驗結(jié)果重復(fù)性好等，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域[7]。本研究中長爪沙鼠糖尿病模型近交系的26個生化位點標(biāo)記電泳表型一致，未發(fā)現(xiàn)雜合型和多態(tài)性，說明這個近交系動物在上述位點均已純合，已選的26個生化標(biāo)記純合度達(dá)到100%。與文獻(xiàn)報道[3]的CMU/1近交系長爪沙鼠的生化位點標(biāo)記一致。

9對繁殖種鼠統(tǒng)計結(jié)果：長爪沙鼠糖尿病模型近交系1～5胎的出生數(shù)、初生窩重和初生平均重量差異不顯著；胎間隔在20～157 d之間，胎間隔2和3的標(biāo)準(zhǔn)差較大，說明在繁殖第3、4、5胎的胎間隔差異很大；分窩體質(zhì)量為26.5～38.48 g,8周的體質(zhì)量為45.88～56.90 g，離乳率為 68.31%，文獻(xiàn)報道[8]CMU/1的分窩體質(zhì)量為24.73～37.33 g，8周的體質(zhì)量為44.42～54.78 g，離乳率為74.46%；CMU/2的分窩體質(zhì)量為27.39～39.29 g，成年體質(zhì)量為47.88～57.40 g，離乳率為73.92%。比較長爪沙鼠糖尿病模型近交系繁殖性能與CMU/1基本一致，只是離乳率偏低，生長發(fā)育比CMU/2弱。

本文描述長爪沙鼠糖尿病模型近交系的生物學(xué)特性，為品系鑒定、保種繁殖和應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。