穩(wěn)定性冠心病患者外周血單核細(xì)胞亞型分布特征及影響因素

劉森 王丹 萬進(jìn)東 侯霽芯 劉家欣 冉飛 李文章 王沛堅(jiān)

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，衰老與血管穩(wěn)態(tài)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610500）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）仍是當(dāng)下我國最主要死亡原因之一［1］。未來我國CVD的發(fā)病率和患病率仍將穩(wěn)步升高，特別是冠心病等疾?。?］。因此，CVD防治工作面臨巨大的挑戰(zhàn)。穩(wěn)定性冠心?。╯table coronary artery disease，SCAD）是冠心病中最常見的類型，動(dòng)脈粥樣斑塊形成是其主要病理改變。炎癥標(biāo)志物一直被認(rèn)為與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，甚至部分炎癥標(biāo)志物可影響患者預(yù)后［3］。CANTOS三期臨床研究證實(shí)炎癥因子IL-1β特異性拮抗劑卡納單抗可在不影響膽固醇水平前提下，降低高敏C反應(yīng)蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）水平而減少心肌梗死病人心血管臨床終點(diǎn)事件［4］。單核細(xì)胞介導(dǎo)人體固有免疫反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)致動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用［3］。隨著技術(shù)更新，流式細(xì)胞術(shù)分析單核細(xì)胞異質(zhì)性受到關(guān)注，不同單核細(xì)胞亞型可能在動(dòng)脈粥樣硬化疾病中參與不同的炎癥反應(yīng)［5］。隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞可分為經(jīng)典型單核細(xì)胞（classical monocytes，CMs；CD14++CD16-）、中間型單核細(xì)胞（intermediate monocytes，IMs；CD14++CD16+）、非經(jīng)典型單核細(xì)胞（nonclassical monocytes，NCMs；CD14+CD16++）三型［6］。三型單核細(xì)胞在介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮不同作用［5］。目前尚無三色流式分析穩(wěn)定性冠心病患者外周血單核細(xì)胞亞型特征及其影響因素的報(bào)道。本研究以SCAD及排除冠心病患者為研究對(duì)象，觀察兩種人群外周血單核細(xì)胞亞型的分布特征，評(píng)估IMs預(yù)測SCAD的價(jià)值，并探究影響IMs分布的因素，為SCAD早期診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象觀察納入2018年3月至2018年7月在成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院并行冠狀動(dòng)脈造影（coronary angiography，CAG）患者162例。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖及CAG診斷SCAD患者96例（SCAD組），非冠心病患者66例（對(duì)照組）；排除標(biāo)準(zhǔn)：排除既往有經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入史、心胸外科手術(shù)史、重大外傷史，合并貧血、慢性營養(yǎng)不良、心房顫動(dòng)、先天性心臟病，嚴(yán)重心力衰竭、肝臟、腎臟疾病，惡性腫瘤、血液系統(tǒng)、全身免疫性疾病及使用免疫抑制藥者。

1.2一般資料包括年齡、性別、身高、體質(zhì)量、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史等，并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）。所有患者入院后均空腹采集靜脈血，完善血常規(guī)、肝功能、腎功能、脂類測定、hs-CRP、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）等指標(biāo)。

1.3CAG方法與判定標(biāo)準(zhǔn)采用Judkins法行多體位CAG，用造影機(jī)的測量系統(tǒng)由2名有經(jīng)驗(yàn)的介入心臟病學(xué)醫(yī)師進(jìn)行判讀，分析左主干、前降支、回旋支、右冠狀動(dòng)脈及其大分支的狹窄程度。以病變管腔最重處狹窄≥50%記為陽性，診斷冠心病，＜50%記為陰性，診斷非冠心病。

1.4三色流式細(xì)胞術(shù)分析外周血單核細(xì)胞亞型對(duì)所有入選患者抽取肘靜脈血2 mL，置于二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，混勻后2 h內(nèi)進(jìn)行染色及流式上機(jī)。實(shí)驗(yàn)抗體如下：抗CD14-FITC、抗CD16-PE、抗 CD86-PE-Cy5，均購于美國 eBioscience公司。BD Acurri C6流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。cell staining buffer購于美國bioLegend公司，紅細(xì)胞裂解液購于中國博士德公司。

1.4.1樣品制備（1）取1.5 mL高壓滅菌后的EP管若干，標(biāo)記全陰管（無抗體）、單陽管（分別加入2 μL 的抗 CD14-FITC、抗 CD16-PE、抗 CD86-PECy5等3種流式熒光抗體之一）、全陽管（分別加入2 μL上述三種抗體）。（2）應(yīng)用全陰管、單陽管調(diào)整各個(gè)通道的熒光補(bǔ)償。（3）將其中一名受試者全血100 μL加入至全陰管、單陽管，應(yīng)用移液器吹打混勾，避光孵育15 min進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測方案的調(diào)試。（4）將受試者100 μL全血分別加入相應(yīng)單陽管、全陽管中，移液器吹打混勻。避光孵育15 min，進(jìn)行免疫熒光染色。（5）向管內(nèi)加1 mL紅細(xì)胞裂解液，渦旋混勻。避光孵育10 min，充分裂解紅細(xì)胞，離心棄上清，加入1 mL cell staining buffer重復(fù)洗滌2～3次，最后定容至100 μL。選擇調(diào)制好的流式程序進(jìn)行檢測。

1.4.2流式上機(jī)（1）數(shù)據(jù)采集：抗體熒光染料FITC，PE，PE-Cy5的激發(fā)光波長均為488nm，發(fā)射光波長分別為525 nm，572 nm，675 nm。在流式細(xì)胞儀對(duì)應(yīng)的通道分別為 FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3。（2）根據(jù)FSC vs SSC（即前向散射光forward scatter，F(xiàn)SC和側(cè)向散射光side scatter，SSC）調(diào)整流式細(xì)胞儀程序電壓，建立二維點(diǎn)圖，初步顯示外周血各群細(xì)胞。（3）根據(jù)二維點(diǎn)圖圈出粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞設(shè)門P1。（4）在P1基礎(chǔ)上建立橫坐標(biāo)為CD86-PE-Cy5，縱坐標(biāo)為SSC的散點(diǎn)圖。根據(jù)細(xì)胞表達(dá)CD86熒光強(qiáng)度的不同和細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度，圈出外周血單個(gè)核細(xì)胞設(shè)門P3。（5）在P3基礎(chǔ)上，以CD14-FITC為橫坐標(biāo)，以CD16-PE為縱坐標(biāo)作二維點(diǎn)圖。將單核細(xì)胞進(jìn)一步分為CD14++CD16-亞型、CD14++CD16+亞型和CD14+CD16++亞型，記錄各亞型比例。見圖1。

圖1 三色流式分析外周血單核細(xì)胞亞型Fig.1 A three-color flow cytometric analysis for peripheral blood monocyte subset

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)性分析；計(jì)數(shù)資料以率或者百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用X2檢驗(yàn)；非正態(tài)性分布資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（Q1～Q3）表示，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，Spearman秩相關(guān)性分析。對(duì)具有差異的因素校準(zhǔn)影響因素后進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。利用受試者工作特征（ROC）曲線分析單核細(xì)胞亞型預(yù)測SCAD的價(jià)值，并計(jì)算最佳界值及陽性預(yù)測值，用曲線下面積（AUC）及Z檢驗(yàn)來判別預(yù)測能力及檢驗(yàn)差異。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般臨床資料比較見表1。

2.2 多因素Logistic回歸分析校正混雜因素后，外周血IMs比例、hs-CRP水平為SCAD獨(dú)立相關(guān)因素。進(jìn)一步校正年齡、性別、吸煙、肥胖、高血壓病史、糖尿病史、高脂血癥病史等冠心病高危因素后，IMs與hs-CRP獨(dú)立相關(guān)。見表2。

表1 兩組患者一般臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics between SCAD and control group

表2 SCAD多因素Logistic回歸分析Tab.2 Multivariate analysis of clinical indicators and SCAD

2.3 外周血IMs比例與hs-CRP水平相關(guān)性分析外周血IMs比例與hs-CRP水平呈顯著性正相關(guān)。見圖2。

2.4 外周血IMs比例預(yù)測SCAD的ROC曲線外周血IMs比例ROC曲線 AUC=0.824，95%CI：0.756～ 0.879，P＜ 0.01；敏感度0.625，特異度0.955；IMs對(duì)應(yīng)診斷SCAD臨界值：8.68%；陽性預(yù)測價(jià)值85.7%。見圖3。

3 討論

炎癥反應(yīng)學(xué)說是動(dòng)脈粥樣硬化形成主流學(xué)說之一。從血管保護(hù)屏障內(nèi)皮細(xì)胞損傷開始，機(jī)體炎癥反應(yīng)即被激活，通過單核細(xì)胞參與的固有免疫反應(yīng)及淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)釋放大量的炎癥因子，如促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6，抗炎性因子IL-4、IL-10、IL-13。在長期慢性炎癥損傷及修復(fù)過程中，動(dòng)脈粥樣斑塊逐漸形成［7］。部分炎癥標(biāo)志物可預(yù)測心血管疾病發(fā)生、評(píng)估病變程度、影響預(yù)后等。CRP是機(jī)體響應(yīng)IL-6等促炎性因子的表達(dá)，由肝細(xì)胞合成的炎癥蛋白，被認(rèn)為與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)［8］。SUNG等［9］發(fā)現(xiàn)男性C反應(yīng)蛋白水平顯著高于女性，在長達(dá)近5年的隨訪中發(fā)現(xiàn)男性CRP水平與CVD及全因死亡率相關(guān)，且獨(dú)立于其它心血管危險(xiǎn)因素。CRP水平不僅影響預(yù)后，還可判斷不穩(wěn)定性心絞痛患者病情，CRP與冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度密切相關(guān)［10］。一方面，CRP可上調(diào)內(nèi)皮粘附分子表達(dá)誘導(dǎo)單核細(xì)胞粘附于受損傷內(nèi)皮，促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化、分泌組織因子加快動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程；另一方面，CRP也受到單核細(xì)胞分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)［11］。本研究結(jié)果顯示SCAD患者h(yuǎn)s-CRP水平顯著高于非冠心病患者，進(jìn)一步行多因素分析提示hs-CRP與SCAD獨(dú)立相關(guān)。但研究樣本例數(shù)較少，且入選患者就診時(shí)間較集中，不排除假陽性可能。

圖3 外周血IMs比例預(yù)測SCAD的ROC曲線Fig.3 ROC curve of predicting SCAD for peripheral blood IMs

單核細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，參與病原微生物的吞噬、抗原呈遞、T細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等重要過程。單核細(xì)胞被證實(shí)具有異質(zhì)性，既往研究大多將單核細(xì)胞分為經(jīng)典與非經(jīng)典兩型，OZAKI等［12］基于這種二分法的研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)中CD14+CD16+單核細(xì)胞亞型是穩(wěn)定性心絞痛患者冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重程度的生物學(xué)標(biāo)志之一。隨著對(duì)單核細(xì)胞異質(zhì)性研究的深入，人們根據(jù)單核細(xì)胞表面脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）受體（CD14）和IgG Fc段受體γIII（FcyIII）（CD16）的表達(dá)水平，將單核細(xì)胞分為3個(gè)亞型：CMs，IMs，NCMs。不同表型分化的單核細(xì)胞存在功能差異及互補(bǔ)，參與不同的炎癥反應(yīng)，在特定情況下也可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化［13］。IMs比例增加被認(rèn)為與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病相關(guān)［14］。IMs比例還被認(rèn)為可能影響心血管疾病預(yù)后。在一項(xiàng)隊(duì)列研究中，IMs可獨(dú)立預(yù)測住院行CAG患者的心血管事件［15］。本研究證實(shí)SCAD患者外周血IMs比例顯著高于非冠心病患者，與SCAD獨(dú)立相關(guān)，且還提出了IMs比例預(yù)測SCAD的最佳臨界值。

IMs與動(dòng)脈粥樣硬化形成的聯(lián)系被認(rèn)為可能與促炎性因子表達(dá)相關(guān)。IMs介導(dǎo)分泌TNF-α和IL-1β等促炎性細(xì)胞因子均強(qiáng)于其他兩型細(xì)胞，且在許多慢性炎癥性疾病中IMs比例顯著增多［16］。英國學(xué)者通過動(dòng)態(tài)觀察急性ST段抬高性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞亞型變化，發(fā)現(xiàn)急性期IMs比例顯著升高，且與IL-6的升高一致［17］。KRYCHTIUK等［18］將冠心病患者按照脂蛋白a水平劃分高水平組和低水平組，結(jié)果顯示高水平組IMs比例顯著高于低水平組，且促炎性因子IL-6、CRP顯著升高，而抗炎性因子IL-10無明顯差異。MOKHTAR等［19］采用流式設(shè)門策略，將單核細(xì)胞分為CD14+CD16-，CD14+CD16+兩型，證實(shí)CD14+CD16+的比例與穩(wěn)定性心絞痛患者冠狀動(dòng)脈病變程度及CRP水平呈正相關(guān)。日本學(xué)者還發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性心絞痛患者IMs較其他兩型細(xì)胞的TLR-4表達(dá)量更高，且與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)［20］。本研究證實(shí)SCAD患者外周血IMs比例與血漿hs-CRP水平呈正相關(guān)。目前大多數(shù)研究支持IMs介導(dǎo)促炎性反應(yīng)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，至于IMs參與具體炎癥反應(yīng)通路及機(jī)制尚無統(tǒng)一結(jié)論，也缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及證據(jù)等級(jí)更高的隨機(jī)、雙盲、多中心、大樣本的臨床研究證實(shí)。

單核細(xì)胞亞型概念的提出以及各亞型功能的確定有助于深入探討疾病發(fā)生的本質(zhì)。IMs比例可能與SCAD相關(guān)，可望成為SCAD潛在的防治靶點(diǎn)。通過干預(yù)單核細(xì)胞表型影響炎性分子表達(dá)可能為SCAD的防治提供新的信息。