艾瑞昔布不同用藥持續(xù)時(shí)間對(duì)大鼠骨折愈合的影響

齊巍 琚紹靜 李嫻 劉偉 張瑞杰 王建生 孫柏山

唐山市第二醫(yī)院（河北唐山 063000）

非甾體抗炎藥（nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血小板聚集、抗風(fēng)濕等作用［1］。尤其選擇性環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑是骨折患者傷后及術(shù)后重要鎮(zhèn)痛藥物。它能選擇性的抑制COX-2，抑制花生四烯酸（arachidonic acid，AA）轉(zhuǎn)化為前列腺素（prostaglandin，PG），從而減少炎性反應(yīng)達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的作用［2］。研究表明雖然特異性COX-2抑制劑在炎癥反應(yīng)和疼痛方面起重要作用，但同時(shí)會(huì)延遲骨折的愈合［3］。國(guó)內(nèi)外研究均表明選擇性COX-2抑制劑能抑制前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的合成，從而抑制如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多種細(xì)胞因子的合成，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞的形成［4］。因此，本研究首選特異性COX-2抑制劑（艾瑞昔布），在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平觀察探討其不同用藥持續(xù)時(shí)間對(duì)大鼠股骨骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑艾瑞昔布（生產(chǎn)批號(hào)：BH2017 0338）購(gòu)于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；兔抗鼠BMP-2和VEGF多克隆抗體均購(gòu)于武漢博士德生物有限公司；ELISA檢測(cè)試劑盒訂購(gòu)于武漢云克隆科技股份有限公司；柜式X線照片機(jī)購(gòu)置于美國(guó)Faxitron公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)置于日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組本實(shí)驗(yàn)選取75只SPF級(jí)健康SD大鼠，體質(zhì)量（350±30）g，12周齡，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）-2016-235。飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障環(huán)境；參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》等效劑量折算表［5］，將艾瑞昔布溶于0.9%Nacl中配制成混懸液灌胃，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常組：生理鹽水灌胃4周；短期用藥組：艾瑞昔布混懸液2 mg/（kg·d），灌胃2周后改用生理鹽水2周；長(zhǎng)期用藥組：艾瑞昔布混懸液2 mg/（kg·d），灌胃4周，大鼠股骨骨折模型構(gòu)建成功后定時(shí)給藥，8 h/次，持續(xù)4周。

1.2.2構(gòu)建動(dòng)物模型10%水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，捆綁固定大鼠，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，沿右側(cè)股骨長(zhǎng)軸行長(zhǎng)約1～1.5 cm縱行切口，依次切開(kāi)皮下組織，鈍性分離股骨干，線鋸鋸斷股骨中斷，電鉆將克氏針順行插入骨折遠(yuǎn)端，穿過(guò)膝關(guān)節(jié)，使骨折端達(dá)到解剖復(fù)位，再將針逆行插入骨折近端，克氏針固定可靠，確保骨折端對(duì)位對(duì)線良好，縫合各層組織，常規(guī)青霉素80萬(wàn)U肌肉注射，2次/d，連續(xù)3 d。

1.2.3組織標(biāo)本制作攝片后10%水合氯醛麻醉，采取急性大失血法處死大鼠，打開(kāi)胸腔，左心室采血5～10 mL，3 000 r/min，離心15 min，收取上層血清0.5～1 mL，-20℃保存?zhèn)溆?。剝離取出右股骨，依次分離軟組織，拔出髓內(nèi)克氏針，保護(hù)骨痂組織，截取骨折端長(zhǎng)約1～2 cm股骨痂，0.9%Nacl沖洗后于10%甲醛溶液固定，10%硝酸脫鈣6周，每周更換脫鈣液，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿骨痂長(zhǎng)軸方向以5 μm連續(xù)切片，切片60℃烤箱4 h，取出室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4放射性（X線）檢查術(shù)后4周各組各選取5只大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后，進(jìn)行X線攝片，觀察大鼠骨折端骨痂生長(zhǎng)和骨折線模糊情況，參考LANE等［6］的X線評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估。

1.2.5骨痂骨密度（BMD）測(cè)量術(shù)后4周各組選取5只大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后，截取右側(cè)股骨，剔除分離軟組織，拔除髓內(nèi)克氏針，保護(hù)骨痂組織，以LUNAR雙能X線吸收儀掃描，以骨折端2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，測(cè)量骨痂骨密度。

1.2.6血清BMP-2和VEGF濃度測(cè)定采用ELISA試劑盒檢測(cè)，取出血清，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品120 μL+標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液120 μL混合均勻；參照操作說(shuō)明書(shū)分別向空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣品孔加入相應(yīng)液體，蓋上封板膜，振蕩均勻，37℃恒溫溫育60 min；配制洗滌液，揭掉封板膜，洗滌液洗滌，分別加入50 μL顯色液A、B，輕輕混勻，放入37℃恒溫箱內(nèi)顯色10 min；空白孔調(diào)零，以450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各組的吸光度值（OD值）。

1.2.7HE染色取出石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇逐級(jí)水化，流水反復(fù)沖洗；蘇木精染色10 min，流水沖洗，細(xì)胞核著色；0.5%～1%鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗30 min，返藍(lán)；顯微鏡下觀察細(xì)胞核是否著色，蒸餾水洗滌洗3～5 s；0.5%伊紅染色2～3 min，流水沖洗；脫水、透明、封片，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.2.8免疫組織化學(xué)染色法取出切片，脫蠟、水化、沖洗，胰酶抗原修復(fù)30 min，PBS洗滌；3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶孵育20 min，PBS洗滌；免疫染色封閉液室溫孵育60 min，PBS洗滌；滴加辣根酶標(biāo)兔抗鼠BMP-2和VEGF抗體，4℃冰箱中孵育過(guò)夜，PBS洗滌；羊抗兔二抗，室溫孵育40 min，PBS洗滌，DAB顯色；蘇木素復(fù)染2～3 min，流水充分沖洗；1%鹽酸酒精分化3～5 s，流水沖洗，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 20.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用（±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析，組間比較采用SNK法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1放射學(xué)觀察及骨折愈合評(píng)分正常組骨折線模糊或消失，骨折端有連續(xù)性骨痂包繞，骨痂體積較大，骨痂愈合，骨折處髓腔再通；短期用藥組骨折線稍模糊，可見(jiàn)部分骨痂生長(zhǎng)，骨折端骨痂連接不緊密；長(zhǎng)期用藥組骨折線依然清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)明顯骨痂生長(zhǎng)，斷端骨痂未連接，骨折愈合欠佳。見(jiàn)圖1。經(jīng)分析，正常組、短期用藥組、長(zhǎng)期用藥組骨折愈合評(píng)分分別為：（4.86 ± 0.38）、（3.76± 0.32）、（2.48±0.12），各組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組較正常組骨折愈合評(píng)分顯著降低，其中短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），長(zhǎng)期用藥組較短期用藥組骨折愈合評(píng)分顯著降低。

圖1 術(shù)后4周X線情況Fig.1 Postoperative 4 weeks X-ray situation

2.2 骨痂BMD測(cè)量正常組、短期用藥組、長(zhǎng)期用藥組骨折端骨痂BMD分別為：0.198±0.028、0.156±0.020、0.123±0.014。各組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組較正常組骨痂BMD顯著降低，其中短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），長(zhǎng)期用藥組較短期用藥組骨痂BMD顯著降低。

2.3 血清BMP-2和VEGF濃度分別測(cè)量正常組、短期用藥組、長(zhǎng)期用藥組血清BMP-2和VEGF濃度（μg/L）分別為：（2.58± 0.52）和（2.77±0.56）、（2.10 ± 0.46）和（2.21 ± 0.50）、（1.42 ± 0.35）和（1.47±0.30）。各組之間差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組較正常組血清BMP-2和VEGF濃度顯著降低，短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），長(zhǎng)期用藥組較短期用藥組血清BMP-2和VEGF濃度均顯著降低。

2.4 組織學(xué)觀察正常組骨痂組織為不成熟骨組織伴有成熟骨組織，可見(jiàn)較多成骨細(xì)胞，骨小梁生長(zhǎng)旺盛，排列致密有序，互相交錯(cuò)網(wǎng)狀；短期用藥組骨痂組織為大量纖維組織軟骨組織，成骨細(xì)胞較少，可見(jiàn)大量軟骨細(xì)胞，骨小梁生長(zhǎng)稍稀疏，排列有序，間隙增寬；長(zhǎng)期用藥組骨痂組織為大量纖維組織，骨小梁生長(zhǎng)稀疏，間隙增寬不連續(xù)，排列紊亂，大量纖維軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞少見(jiàn)。見(jiàn)圖2。

圖2 HE染色觀察骨痂的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Morphological changes of bone callus was observed by HE staining（× 200）

2.5 BMP-2、VEGF表達(dá)BMP-2陽(yáng)性表達(dá)于成骨細(xì)胞及其周圍和骨小梁的邊緣，纖維骨痂中較少，VEGF陽(yáng)性表達(dá)于成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞。依據(jù)免疫反應(yīng)評(píng)分得出正常組、短期用藥組、長(zhǎng)期用藥組的BMP-2、VEGF表達(dá)分別為：（3.83±0.35）和（2.98±0.25）、（3.14 ± 0.27）和（2.25 ± 0.18）、（2.46 ± 0.22）和（1.50±0.10）。各組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組較正常組BMP-2和VEGF陽(yáng)性表達(dá)顯著降低，短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），長(zhǎng)期用藥組較短期用藥組BMP-2和VEGF陽(yáng)性表達(dá)顯著降低。見(jiàn)圖3、4。

3 討論

圖3 免疫組化觀察骨痂組織BPM-2表達(dá)Fig.3 The BPM-2 expression in callus was observed by Immunohistochemical（× 200）

圖4 免疫組化觀察骨痂組織VEGF表達(dá)Fig.4 The VEGF expression in callus was observed by Immunohistochemical（× 200）

創(chuàng)傷性骨折后由諸多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、PG等眾多因素共同參與細(xì)胞生化效應(yīng)誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，并且這些因素在新骨形成及整個(gè)骨折愈合過(guò)程中產(chǎn)生重要作用，骨形成蛋白（bone morphogenic protein，BMPs）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞遷徙、增殖、分化，最終導(dǎo)致軟骨、骨形成的作用［7］。BMP-2具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，導(dǎo)致新骨形成作用，且BMP-2可作用于破骨細(xì)胞誘導(dǎo)其骨吸收活性［8］。VEGF作為血管生成的最重要因子，在骨折愈合血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成發(fā)揮重要作用，能通過(guò)作用于其表面受體，促進(jìn)其增殖和血管生成，為骨折的愈合提供骨再生必需的微環(huán)境［9］。同時(shí)VEGF也參與骨痂轉(zhuǎn)化、成熟的各個(gè)階段，在血管的形成、軟骨的吸收與骨痂的改建的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明COX-2可誘導(dǎo)VEGF、BFGF，從而促進(jìn)血管生成，加速骨折愈合率［10］。COX-2/PGE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可通過(guò)上調(diào)β-catenin表達(dá)，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路上調(diào)VEGF表達(dá)。此外COX-2/PGE2信號(hào)通路還可通過(guò)VEGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其分裂、增殖，并誘導(dǎo)蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶等促進(jìn)微血管形成［11］。研究證實(shí)了COX-2高表達(dá)可以促進(jìn)VEGF生成及血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，COX-2有促進(jìn)新生血管形成的作用［12］。

TAMOTO等［13］在大鼠骨折模型采用塞來(lái)昔布（4 mg/kg·d）和羅非昔布（3 mg/kg·d）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后塞來(lái)昔布組和羅非昔布組仍能發(fā)現(xiàn)骨折線存在。徐曉峰等［14］發(fā)現(xiàn)VEGF、BMP-2在骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究表明［15］BMP-2和VEGF表達(dá)和分布在骨折愈合的不同時(shí)期各不相同，并且共同調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞的增殖和成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的分化，最終完成骨折修復(fù)。同樣本研究結(jié)果也表明特異性COX-2抑制劑-艾瑞昔布對(duì)大鼠骨折愈合有明顯抑制作用，尤其長(zhǎng)期使用對(duì)骨折愈合抑制更加明顯，其可能與降低BMP-2、VEGF表達(dá)有關(guān)。

特異性COX-2抑制劑能夠緩解骨折及骨科手術(shù)后疼痛，盡管有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示特異性COX-2抑制劑對(duì)骨折愈合有不良影響，但是骨折愈合是一個(gè)多種因素參與的復(fù)雜過(guò)程，關(guān)于COX-2抑制劑與骨折愈合具體作用機(jī)制，還需進(jìn)一步大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究，這些方面的研究將會(huì)為我們提供新的思路。使用COX-2抑制劑抑制緩解患者疼痛可以促使患者早期活動(dòng)、負(fù)重，這對(duì)骨折愈合又有促進(jìn)作用，艾瑞昔布是一把雙刃劍，有利也有弊，臨床醫(yī)生應(yīng)該具有足夠的警惕意識(shí)，仔細(xì)衡量利弊，做出正確的臨床決策，合理運(yùn)用，對(duì)于骨折患者的鎮(zhèn)痛，合理的使用NSAIDs藥物，盡量縮短用藥持續(xù)時(shí)間，減少用藥劑量，使艾瑞昔布發(fā)揮最大功效。