Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭對(duì)抑郁癥大鼠前額葉和海馬神經(jīng)元發(fā)生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡的影響

丁迎 戢漢斌 陳鈺 蘇鄒

湖北省武漢市武東醫(yī)院（武漢市第二精神病醫(yī)院）康復(fù)科（武漢 430084）

抑郁癥臨床上常見的病癥，病因相對(duì)復(fù)雜［1］。抑郁癥主要是心情或情感性精神障礙，全球約20%的人群受抑郁癥的困擾［2］。目前，對(duì)于抑郁癥的治療方式很多，但抑郁癥很難被完全治愈。抑郁癥發(fā)病的原因是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的異常導(dǎo)致的［3］，但這種說(shuō)法并不能充分闡釋抗抑郁癥藥物的作用機(jī)制，這說(shuō)明抑郁癥的發(fā)病也有可能是由于其他神經(jīng)遞質(zhì)如氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)異常導(dǎo)致的。海馬是大腦中與情緒認(rèn)知相關(guān)的區(qū)域，是一個(gè)重要的邊緣結(jié)構(gòu)系統(tǒng)［4］。海馬作為應(yīng)激反應(yīng)的靶區(qū)，經(jīng)常在抑郁癥和情緒應(yīng)激的研究中被涉及，并可參與學(xué)習(xí)記憶和情緒反應(yīng)等活動(dòng)［5］。大腦前額葉皮質(zhì)mPFC是控制情緒的中樞組分，抑郁癥患者的mPFC背外側(cè)區(qū)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變［6-7］。長(zhǎng)期慢性應(yīng)激可誘發(fā)海馬和mPFC神經(jīng)元受損，從而使中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生紊亂。γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）和谷氨酸（glutamate，Glu）是主要的抑制性和興奮性遞質(zhì)［8］。在抑郁癥患者的部分腦區(qū)域中，GABA和Glu的濃度異常，平衡被破壞［9］。Toll樣受體4（Toll-like recept 4，TLR4）是Toll樣受體中最早被發(fā)現(xiàn)的亞型之一，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成，在多種組織和細(xì)胞中分布十分廣泛［10］。研究證實(shí)，TLR4具有促進(jìn)炎癥因子分泌的功能，從而引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，TLR4還可促進(jìn)免疫反應(yīng)過(guò)程中免疫細(xì)胞的成熟與分化，具有抗病毒、介導(dǎo)全身免疫病理?yè)p傷、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等生理功能［11］。由于TLR4在炎癥反應(yīng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，其在與炎癥相關(guān)的疾病中的功能成為了研究的熱點(diǎn)。TLR4是一種模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別壞死細(xì)胞以及熱休克蛋白（HSP60、HSP70）等。在神經(jīng)受損部分會(huì)產(chǎn)生大量的壞死細(xì)胞以及HSP60和HSP70，故TLR4在神經(jīng)損傷性疾病中的作用，受到了更多的關(guān)注。目前，對(duì)于TLR4在腦神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的研究仍不多。因此，本研究的創(chuàng)新點(diǎn)即是采用Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭（TAK-242）作用于抑郁癥大鼠模型，探討TLR4對(duì)抑郁癥大鼠模型前額葉（mPFC）和海馬神經(jīng)元發(fā)生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡的影響，以為臨床診治提供理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器雄性SD大鼠，體質(zhì)量約為240～ 280 g，合格證號(hào)：SCXK（滬）0054756，購(gòu)自上海斯萊克景達(dá)有限公司。Toll樣受體4拮抗劑TAK-242購(gòu)自美國(guó)MCE公司；兔抗小鼠TLR4抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；山羊抗兔β-actin抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；組織裂解蛋白提取液和BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；5-HT ELISA試劑盒、Glu ELISA試劑盒和GABA ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司。Western發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥選取60只SD雄性大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為2批，每批SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（Control組）、模型組［用長(zhǎng)期輕度不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）加孤養(yǎng)復(fù)制大鼠抑郁癥模型，Model組］和治療組［Model+TAK-242（3 mg/kg）］。第1批30只大鼠用于自發(fā)活動(dòng)和強(qiáng)迫游泳測(cè)試；第2批30只大鼠用于5-羥色胺（5-HT）、GABA及谷氨酸Glu含量的檢測(cè)，以及TLR4蛋白表達(dá)的測(cè)定。

正常對(duì)照組大鼠進(jìn)行合籠飼養(yǎng)，其余各組大鼠進(jìn)行單只孤養(yǎng)。模型組和治療組大鼠建立CUMS抑郁癥模型，連續(xù)21 d接收不同的刺激，每天選取以下任意一種刺激：24 h禁水、24 h禁食、夾尾1 min、懸尾1 min、通宵照明、4℃冷水游泳5 min、100 V電擊足底1 min、40℃烘箱熱烘5 min等，順序隨機(jī)，使大鼠受到不能預(yù)料的刺激。治療組大鼠同時(shí)注射TAK-242（3 mg/kg）21 d，治療組和模型組大鼠采取腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.2.2曠場(chǎng)試驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳測(cè)試（1）曠場(chǎng)試驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)開始前1 d和實(shí)驗(yàn)開始后第22天，用ENV-520動(dòng)物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)對(duì)大鼠的自發(fā)活動(dòng)記錄3 min并進(jìn)行分析。（2）強(qiáng)迫游泳測(cè)試：準(zhǔn)備水溫為（25±1）℃的測(cè)試桶，分別于第1和22天預(yù)先強(qiáng)迫游泳15 min，24 h后再次強(qiáng)迫游泳5 min，并記錄5 min內(nèi)的不動(dòng)狀態(tài)時(shí)間。

1.2.3大鼠mPFC和海馬中5-HT、GABA及Glu含量的檢測(cè)3組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行斷頭處死，冰上分離前額葉與海馬，置于液態(tài)氮中凍存后，可冷凍于-80℃冰箱待測(cè)。對(duì)所取的大鼠組織進(jìn)行勻漿，并使用ELISA試劑盒測(cè)定大鼠mPFC和海馬中5-HT、GABA及Glu的含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4Western印跡法檢測(cè)大鼠mPFC和海馬組織TLR4的蛋白表達(dá)將大鼠的mPFC和海馬組織分別置于研缽中，加入一定體積的蛋白裂解液對(duì)組織進(jìn)行充分研磨，于冰上裂解30 min后，在4℃下、12 000×g離心10 min，吸取上清液，并使用BCA蛋白濃度試劑盒對(duì)其進(jìn)行蛋白定量。

選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，取20 μL蛋白樣品進(jìn)行上樣，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用10%的脫脂乳粉溶液進(jìn)行封閉2 h后，一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜。使用TBST洗膜3次，每次15 min，二抗（1∶4 000）室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次。使用化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白進(jìn)行顯色，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1自發(fā)活動(dòng)與強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間如表1所示，造模前，各組大鼠自發(fā)活動(dòng)總路程差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠自發(fā)活動(dòng)總路程減少（P＜0.01），強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.01）。與模型組相比，TAK-242治療組大鼠自發(fā)活動(dòng)總路程增加（P＜0.01），強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短（P＜0.01），而與正常對(duì)照組相比無(wú)差異（P＞0.05）。

表1 自發(fā)活動(dòng)與強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間Tab.1 Spontaneous activity and forced swimming time ± s

表1 自發(fā)活動(dòng)與強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間Tab.1 Spontaneous activity and forced swimming time ± s

注:與正常對(duì)照組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組TAK-242治療組P值只數(shù)10 10 10-自發(fā)活動(dòng)總路程（cm）造模前304.64±107.45 313.73±114.23 312.23±79.25＜0.05造模后499.43±128.14 127.24±37.17**413.85±118.32##＜0.05強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間（s）93.23±10.44 131.64±17.45**183.23±11.43##＜0.05

2.2各組大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量如表2所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量均降低（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量均升高（P＜0.01）。說(shuō)明TAK-242治療大鼠后，可提高大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量。

2.3各組大鼠mPFC和海馬中GABA的含量如表3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠mPFC和海馬中GABA的含量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠mPFC和海馬中GABA的含量均顯著升高（P＜0.01）。說(shuō)明TAK-242治療大鼠后，可提高大鼠mPFC和海馬中GABA的含量。

表2 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量Tab.2 The content of 5-HT in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

表2 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量Tab.2 The content of 5-HT in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

注：與正常對(duì)照組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組TAK-242治療組P值只數(shù)10 10 10-5-HT含量（μmol/L）mPFC 1.23±0.14 0.64±0.12**1.23±0.11##＜0.05海馬1.64±0.25 0.93±0.13**1.33±0.09##＜0.05

表3 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中GABA的含量Tab.3 The content of GABA in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

表3 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中GABA的含量Tab.3 The content of GABA in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

注：與正常對(duì)照組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組TAK-242治療組P值只數(shù)10 10 10-GABA含量（μmol/L）mPFC 58.21±16.13 37.62±13.13**73.22±18.12##＜0.05海馬154.61±35.21 52.95±15.15**213.33±44.02##＜0.05

2.4各組大鼠mPFC和海馬中Glu的含量如表4所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠mPFC和海馬中Glu的含量均升高（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠mPFC和海馬中Glu的含量均降低（P＜0.01）。這說(shuō)明TAK-242治療大鼠后，可減低大鼠mPFC和海馬中Glu的含量。

表4 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中Glu的含量Tab.4 The content of Glu in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

表4 各組大鼠大鼠mPFC和海馬中Glu的含量Tab.4 The content of Glu in mPFC and hippocampus of rats in each group ± s

注：與正常對(duì)照組相比，**P＜0.05；與模型組相比，##P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組TAK-242治療組P值只數(shù)10 10 10-Glu含量（μmol/L）mPFC 21.22±6.15 39.63±9.18**27.26±8.42##＜0.05海馬27.64±7.53 56.93±12.14**30.37±9.47##＜0.05

2.5各組大鼠mPFC中TLR4蛋白含量的比較如圖1所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠mPFC中TLR4蛋白的表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠mPFC中TLR4蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.01）。說(shuō)明TAK-242治療大鼠后，可下調(diào)大鼠mPFC中TLR4蛋白的表達(dá)量。

圖1 各組大鼠mPFC中TLR4蛋白含量的比較Fig.1 Comparison of TLR4 protein content in mPFC of rats in each group

2.6 各組大鼠海馬中TLR4蛋白含量的比較如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬中TLR4蛋白的表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TAK-242治療組大鼠海馬中TLR4蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.01）。說(shuō)明TAK-242治療大鼠后，可下調(diào)大鼠海馬中TLR4蛋白的表達(dá)量。

圖2 各組大鼠海馬中TLR4蛋白含量的比較Fig.2 Comparison of TLR4 protein contents in hippocampus of rats in each group

3 討論

抑郁癥已成為臨床上較難治愈的病癥，長(zhǎng)期輕度不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)病的主要因素［12］。CUMS建立的大鼠抑郁癥模型能很好地模擬抑郁癥的某些癥狀和病因，因此，本研究采用CUMS加孤養(yǎng)建立大鼠抑郁癥模型，初步研究Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭（TAK-242）對(duì)抑郁癥大鼠模型前額葉（mPFC）和海馬神經(jīng)元發(fā)生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡的影響。本研究證實(shí)，抑郁癥模型大鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)比正常組減少，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，即模型組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力有所下降，正處于抑郁癥發(fā)病狀態(tài)，這證實(shí)抑郁癥大鼠模型建模成功。

抑郁癥的發(fā)生與腦內(nèi)單胺遞質(zhì)5-HT的缺乏有著密切相關(guān)［13］。本研究結(jié)果證實(shí)，與正常對(duì)照組相比，抑郁癥大鼠mPFC和海馬中的5-HT顯著降低，而TAK-242治療組與模型組相比，大鼠mPFC和海馬中5-HT的含量均顯著升高，這說(shuō)明抑郁癥模型大鼠的發(fā)病與腦內(nèi)單胺遞質(zhì)5-HT的表達(dá)量低有關(guān)，同時(shí)Toll樣受體4拮抗劑TAK-242可以提高大鼠mPFC和海馬中5-HT的表達(dá)量，對(duì)抑郁癥有緩解作用。

抑郁癥的發(fā)生不僅與5-HT的表達(dá)降低有關(guān)，還與GABA和Glu有關(guān)聯(lián)。在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中，5-HT、Glu和GABA在情感障礙發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Glu是海馬內(nèi)的重要興奮性遞質(zhì)，其與學(xué)習(xí)記憶和情緒控制關(guān)系密切［14-15］。GABA參與腦內(nèi)胺類、肽類和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控功能，抑郁癥患者腦組織中GABA濃度較正常對(duì)照顯著下調(diào)，Glu濃度顯著上升，說(shuō)明抑郁患者大腦GABA和Glu濃度失衡，大腦神經(jīng)傳遞受損［16］。本研究表明，大鼠mPFC和海馬中Glu含量上升，GABA含量降低；而TAK-242治療組與模型組相比，大鼠mPFC和海馬中Glu含量降低，GABA含量顯著升高。Toll樣受體4拮抗劑TAK-242可提高GABA含量，降低Glu含量，夠使抑制性氨基酸與興奮性氨基酸趨于平衡，有利于恢復(fù)抑郁癥患者的正常情緒和認(rèn)知功能，這可能是抑郁癥得到緩解的機(jī)制之一。

TLR4是Toll樣受體家族的I型膜受體，不僅能夠識(shí)別外源性配體，還能夠識(shí)別內(nèi)源性配體，因此可被神經(jīng)損傷部位的內(nèi)源性配體激活［17］。TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要的功能，參與腦組織損傷后的炎癥反應(yīng)，包括帕金森病、阿爾茨海默病以及肌萎縮側(cè)索硬化等神經(jīng)變性疾?。?8-20］。本研究結(jié)果顯示，大鼠mPFC和海馬中TLR4的蛋白與正常對(duì)照組相比表達(dá)量上調(diào)，而TAK-242治療組與模型組相比，大鼠mPFC和海馬中TLR4的蛋白表達(dá)量下調(diào)。這說(shuō)明TAK-242注射抑郁癥模型大鼠后，能夠使大鼠mPFC和海馬中TLR4的蛋白表達(dá)量下調(diào)，推測(cè)TLR4通路與抑郁癥大鼠模型前額葉和海馬神經(jīng)元發(fā)生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡有關(guān)。

本研究的新穎之處在于采用Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭（TAK-242）作用于抑郁癥大鼠模型，同時(shí)測(cè)量前額葉和海馬神經(jīng)元發(fā)生和γ-氨基丁酸谷氨酸平衡，從而可以全面評(píng)價(jià)Toll樣受體4拮抗劑厄立特蘭（TAK-242）治療抑郁癥的效果和機(jī)制。本研究的不足是沒(méi)有評(píng)估在該過(guò)程中神經(jīng)遞質(zhì)的變化，這也是本課題組下一步研究的方向，即采用微透析技術(shù)探究厄立特蘭（TAK-242）治療抑郁癥時(shí)各腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的變化。

綜上所述，TLR4抑制劑TAK-242對(duì)SD小鼠抑郁癥具有緩解作用，其作用包括改善大鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力、提高5-HT的含量、控制γ-氨基丁酸和谷氨酸的平衡以及降低TLR4的蛋白表達(dá)量。推測(cè)TAK-242的抑郁癥緩解作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究為抑郁癥提供了新的治療思路，并為深入探討TAK-242的抑郁癥緩解機(jī)制（即抗炎分子機(jī)制）奠定基礎(chǔ)。