COX-2、MMP-9和VEGF在子宮腺肌病異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的表達及其意義

李燦宇 劉歡歡 王婷婷 陳增鑫 申愛榮 封全靈

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科（鄭州 450052）

子宮腺肌病嚴重危害婦女健康，但仍缺乏有效的臨床治療策略［1］。子宮腺肌病可能具有較為獨特的分子病理學(xué)特征［2］，了解其發(fā)病機制對尋找有效治療策略有重要意義。本課題組前期研究表明COX-2、VEGF、MMP-9表達下降與子宮腺肌病間質(zhì)細胞凋亡有關(guān)［3］。為進一步探討三者與子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本研究通過免疫組化研究了子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF、MMP-9的蛋白表達及相關(guān)性，通過分離間質(zhì)細胞，實時定量PCR（real-time PCR）和western blot方法檢測了子宮腺肌病組織間質(zhì)細胞中COX-2、VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白表達，并觀察了間質(zhì)細胞中COX-2基因沉默對VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白表達的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料標本來自2013年12月至2015年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科行腹腔鏡或開腹手術(shù)的子宮腺肌病患者，收集在位、異位內(nèi)膜新鮮組織各30例，選取同期正常內(nèi)膜新鮮組織10例（排除子宮腺肌病、內(nèi)膜異位癥及其他婦科良性疾病）作為正常對照，另外收集40例異位內(nèi)膜組織石蠟包埋標本。全組病例年齡25～54歲（各組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義），術(shù)前3個月無激素使用史，診斷經(jīng)腹腔鏡、病理診斷證實。手術(shù)室中獲取無菌標本后立即置于無菌4℃預(yù)冷的含有青、鏈霉素的DMEM/F-12（FD）培養(yǎng)液，1 h內(nèi)送至實驗室在生物安全柜中進行培養(yǎng)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會審議同意，所有標本采集均經(jīng)患者知情同意。兔抗人多克隆抗體COX-2（12375-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測兔抗人多克隆抗體COX-2（12375-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。兔抗人單克隆抗體MMP-9（ZA-0562）和兔抗人多克隆抗體VEGF（ZA-0509）購自北京中杉金橋生物科技有限公司。所有組織標本經(jīng)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察病理變化，用Envision免疫組化二步法檢測蛋白表達情況。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，陽性對照切片由試劑公司提供，染色結(jié)果陽性。陰性對照用PBS緩沖液代替一抗，染色結(jié)果陰性。

1.2.2免疫組化結(jié)果判定方法每張切片選10個高倍視野（400倍），根據(jù)染色程度及染色范圍來計算評分。按陽性細胞所占百分比評分：無陽性細胞者為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；按染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以陽性細胞所占百分比與染色強度評分的乘積為總評分，總評分≤6為低表達，總評分＞6為高表達。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測間質(zhì)細胞原代培養(yǎng)與鑒定，siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備和瞬時轉(zhuǎn)染方法見前期研究［3］。提取各組細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行實時定量PCR擴增。反應(yīng)體系為20 μL，包含SYBR Green Master（ROX）試劑10 μL、上下游引物各 0.6 μL、模板 cDNA 1.0 μL 和 RNase-Free Water 7.8 μL；擴增程序為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)。生成定量標準曲線圖，計算機分析Ct值。計算方法：目的基因的相對定量值 =2-△△Ct。抑制率（%）=（1-干擾組COX-2 mRNA相對表達量/空白對照組COX-2 mRNA相對表達量）×100%。

1.2.4Western blot檢測收集轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染48 h后的細胞提取總蛋白，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；用1×PBS配制的5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，棄去牛奶，加入一抗兔抗人COX-2、VEGF、MMP-9和鼠抗人β-actin抗體（cell signal technology），于4℃下孵育過夜；PBST洗滌3次，用HRP標記的抗鼠的二抗于室溫孵育2 h后檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包對所得數(shù)據(jù)進行處理。所有計量資料以均數(shù)±標準差表示，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析（ANOVA），多樣本均數(shù)間的兩兩比較采用最小意義差異法（LSD-t檢驗）或Tamhane′s T2法，兩獨立樣本均數(shù)之間的比較采用t檢驗。用χ2檢驗分析COX-2、MMP-9和VEGF高表達情況，采用Pearson相關(guān)性檢驗進行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF和MMP-9高表達及其相關(guān)性COX-2、VEGF和MMP-9蛋白主要在異位內(nèi)膜腺體細胞和間質(zhì)細胞胞漿中表達（圖1），子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF和MMP-9蛋白高表達率分別為57.5%（23/40）、45.0%（18/40）和37.5%（15/40）。Pearson相關(guān)性分析顯示COX-2和VEGF高表達呈顯著正相關(guān)（r=0.676，P=0.000），COX-2和MMP-9高表達呈顯著正相關(guān)（r=0.457，P=0.003），MMP-9和VEGF高表達呈顯著正相關(guān)（r=0.441，P=0.004）。

2.2子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中COX-2、VEGF和MMP-9 mRNA的相對表達如表1所示，子宮腺肌病患者離體培養(yǎng)的在位、異位間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA的表達均明顯高于正常對照組（P＜0.05），且異位間質(zhì)細胞中的表達均顯著高于對應(yīng)在位內(nèi)膜（P＜0.05）。

2.3子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相對表達如表2所示，子宮腺肌病組患者離體培養(yǎng)的在位、異位間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相對表達均明顯高于正常對照組（P＜0.05），且異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞（ESC）mRNA和蛋白的表達均明顯高于對應(yīng)在位內(nèi)膜（P＜0.05）。

圖1 免疫組化檢測COX-2、VEGF和MMP-9蛋白在異位內(nèi)膜組織腺體和間質(zhì)細胞中的表達（Envision二步法，箭頭示間質(zhì)細胞陽性表達）Fig.1 Expression of COX-2，VEGF and MMP-9 proteins in adenomyosis ectopic endometrium by immunohistochemistry（Envision staining，arrows show positive stromal cells）

表1 子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常對照組間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相對表達（n=10）Tab.1 RelativeexpressionofCOX-2，MMP-9andVEGFmRNA in adenomyosis and control stromal cells（n=10） ± s

表1 子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常對照組間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相對表達（n=10）Tab.1 RelativeexpressionofCOX-2，MMP-9andVEGFmRNA in adenomyosis and control stromal cells（n=10） ± s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與對應(yīng)在位內(nèi)膜組比較，△P＜0.05

組別異位內(nèi)膜組*△在位內(nèi)膜組*正常對照組COX-2 3.460 7±0.312 2.193 3±0.599 1.467 0±1.280 VEGF 3.921 4±0.690 2.654 9±0.628 1.245 3±0.729 MMP-9 2.747 3±0.972 1.557 7±0.590 1.012 5±0.162

表2 子宮腺肌病和正常對照間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相對表達（n=10）Tab.2 RelativeexpressionofCOX-2，MMP-9andVEGFproteinin adenomyosis and control stromal cells（n=10） ± s

表2 子宮腺肌病和正常對照間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相對表達（n=10）Tab.2 RelativeexpressionofCOX-2，MMP-9andVEGFproteinin adenomyosis and control stromal cells（n=10） ± s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與對應(yīng)在位內(nèi)膜組比較，△P＜0.05

組別異位內(nèi)膜組*△在位內(nèi)膜組*正常對照組0.795 6±0.012 0.694 4±0.016 0.245 3±0.016 0.885 5±0.018 0.782 8±0.015 0.122 6±0.008 0.818 8±0.007 0.712 4±0.129 0.074 0±0.009 COX-2VEGF MMP-9

2.4COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA的相對表達沉默COX-2基因后，與陰性對照組和空白對照組相比，子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA的相對表達量均顯著下降，陰性對照組和空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3、4）。

表3 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相對表達（n=10）Tab.3 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF mRNA in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing（n=10） ± s

表3 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF mRNA相對表達（n=10）Tab.3 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF mRNA in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing（n=10） ± s

注：與陰性組比較，*P＜0.05；與空白組比較，△P＜0.05，#P＞0.05

組別干擾組*△陰性組#空白組COX-2異位0.897 8±0.025 3.162 4±0.485 3.460 7±0.3120在位0.919 2±0.163 1.936 7±0.096 2.193 3±0.599 VEGF異位1.082 5±0.310 3.168 1±0.356 3.921 4±0.690在位1.442 3±0.223 2.432 9±0.467 2.654 9±0.628 MMP-9異位0.768 0±0.268 2.438 9±0.302 2.747 3±0.972在位0.791 2±0.173 1.648 9±0.351 1.557 7±0.590

表4 COX-2基因沉默后各組VEGF、MMP-9 mRNA表達的下降率Tab.4 Decrease rate of VEGF and MMP-9 mRNA in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s，%

表4 COX-2基因沉默后各組VEGF、MMP-9 mRNA表達的下降率Tab.4 Decrease rate of VEGF and MMP-9 mRNA in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s，%

注：與對應(yīng)在位內(nèi)膜組，*P＜0.05

組別子宮腺肌病異位內(nèi)膜組*子宮腺肌病在位內(nèi)膜組VEGF 71.80±9.25 42.15±17.69 MMP-9 70.79±8.30 41.50±27.48

2.5 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相對表達沉默COX-2基因后，與陰性對照組和空白對照組相比，子宮腺肌病在位、異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白的相對表達量均顯著下降，陰性對照組和空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2，表5、6）。

圖2 Westernblot檢測COX-2基因沉默后AM各組及正常對照組ESC中COX-2、VEGF及MMP-9蛋白相對表達Fig.2 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF protein in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis and controls after COX-2 gene silencing detected by western-blot

表5 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相對表達Tab.5 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF protein in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing ± s

表5 COX-2基因沉默后子宮腺肌病在位、異位間質(zhì)細胞中COX-2、MMP-9和VEGF蛋白相對表達Tab.5 Relative expression of COX-2，MMP-9 and VEGF protein in eutopic and ectopic stromal cells of adenomyosis after COX-2 gene silencing ± s

注：與陰性組比較，*P＜0.05；與空白組比較，△P＜0.05，#P＞0.05

組別干擾組*△陰性組#空白組COX-2異位0.453 6±0.014 0.785 3±0.009 0.795 6±0.012在位0.469 5±0.010 0.691 4±0.015 0.694 4±0.016 VEGF異位0.369 5±0.008 0.886 2±0.012 0.885 5±0.018在位0.495 2±0.015 0.780 8±0.015 0.782 8±0.015 MMP-9異位0.290 6±0.009 0.812 9±0.010 0.818 8±0..007在位0.387 5±0.007 0.706 0±0.013 0.712 4±0.129

表6 COX-2基因沉默后子宮腺肌病各組VEGF、MMP-9蛋白表達的下降率Tab.6 Decrease rate of VEGF and MMP-9 protein in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s，%

表6 COX-2基因沉默后子宮腺肌病各組VEGF、MMP-9蛋白表達的下降率Tab.6 Decrease rate of VEGF and MMP-9 protein in adnomyosis after COX-2 gene slilencing ± s，%

注：與對應(yīng)在位內(nèi)膜組，*P＜0.05

組別異位內(nèi)膜組*在位內(nèi)膜組VEGF 58.25±1.53 36.69±3.01 MMP-9 64.50±1.16 45.59±1.75

3 討論

子宮腺肌病是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細胞在子宮肌層彌漫性或局限性生長，引起痛經(jīng)、月經(jīng)過多和不孕不育，嚴重影響患者身心健康的一種疾病，其發(fā)病機制尚不清楚［4］。目前的研究認為AD發(fā)病的分子機制包括5個方面：炎性因子、細胞外基質(zhì)酶、生長因子、性激素受體及神經(jīng)血管生成因子［5］。子宮內(nèi)膜的異位侵襲及血管生成是子宮內(nèi)膜侵入肌層并生長發(fā)育的必備條件，新生血管的形成需要多種血管形成相關(guān)因子的協(xié)同作用，包括VEGF、COX-2、MMP及血管生成素（angiogenin，Ang）等［6］。其中COX-2、MMP和VEGF分別代表了AD發(fā)病機制中的炎性因子、細胞外基質(zhì)及生長因子三個方面，研究其三者與AD的關(guān)系可以進一步探索AD的發(fā)生機制，為其靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

COX-2為花生四烯酸合成酶的限速酶，可將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)镻GE2，PGE2作為芳香化酶P450的誘導(dǎo)因子，可促進E2的合成，E2又可刺激COX-2的合成，故COX-2、PGE2、P450、E2形成了一個惡性循環(huán)［7］。在子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型中抑制COX-2可通過降低PGE2的表達水平，從而抑制VEGF表達影響血管生成［8］。這些研究提示COX-2可能是影響子宮內(nèi)膜異位疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因子。

VEGF作為最強的血管生成因子，其高水平表達與子宮腺肌病發(fā)生關(guān)系密切，其高表達的致病機制尚不清楚［9］。雌激素可通過誘導(dǎo)VEGF高表達及血管生成促進子宮腺肌病的發(fā)生［10］。MMP-9是一種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，其高表達與AD的發(fā)生密切相關(guān)［11］，多種信號通路可通過調(diào)節(jié)MMP-9參與子宮腺肌病的發(fā)生［12］。本研究通過免疫組化方法檢測了子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF和MMP-9蛋白表達，結(jié)果顯示三者在子宮腺肌病組織中均呈高表達，且存在顯著正相關(guān)。結(jié)果提示COX-2可能與VEGF、MMP-9一起共同參與了子宮腺肌病的發(fā)生和異位侵襲。

子宮內(nèi)膜上皮細胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化是子宮腺肌病發(fā)生的重要分子病理機制，間質(zhì)細胞增殖和侵襲成為子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展的重要因素［13-14］。子宮腺肌病的內(nèi)膜異位的發(fā)生與腫瘤細胞的惡性侵襲行為類似，有研究表明，在腫瘤細胞中選擇性抑制COX-2表達能顯著改變VEGF和MMP-9表達，并抑制腫瘤發(fā)展［15］。本研究通過對間質(zhì)細胞的分離和鑒定，檢測了間質(zhì)細胞中MMP-9、VEGF和COX-2的表達情況，結(jié)果顯示三者在子宮腺肌病內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的表達顯著高于正常對照，尤其在異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中更為顯著，結(jié)果提示三者表達上調(diào)可能在間質(zhì)細胞侵襲中發(fā)揮重要作用。而當在子宮腺肌病間質(zhì)細胞中沉默COX-2基因后，在位、異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中VEGF、MMP-9的表達顯著下調(diào)，尤其在異位間質(zhì)細胞中更為明顯。這提示子宮腺肌病間質(zhì)細胞中COX-2可能是VEGF、MMP-9通路的上游因子，COX-2可能通過對VEGF、MMP-9表達調(diào)節(jié)參與了該疾病的發(fā)生，針對該通路機制有望探索子宮腺肌病新的治療策略。

目前AD的發(fā)病病因不明，研究多限于從患者或動物模型中檢測不同因子在AD及對照組織中的表達情況。本研究同時從細胞學(xué)及組織學(xué)檢測MMP-9、VEGF和COX-2在AD中的表達情況，同時對三者的相互關(guān)系進行研究，結(jié)果表明三者共同參與了AD發(fā)生發(fā)展，COX-2可能是AD發(fā)病的關(guān)鍵因子，有望成為治療AD的分子靶點。本研究病例數(shù)也有一定局限性，尚需大樣本量的研究進一步證實。