NaCl、KCl和葡萄糖對大鱗鲃精子活力的影響

丁辰龍，王宣朋，李 康，覃寶利，葉建勇，藺玉華

（1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院宿遷農(nóng)科所，江蘇宿遷 223800；2.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007）

大鱗鲃（Barbus capito）隸屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鲃屬（Barbus）[1]，具有耐鹽堿、食性廣、肉質(zhì)好、生長快速等優(yōu)良性狀[2]，是貴重的大型經(jīng)濟魚類.為了改變我國東北、華北和西北地區(qū)鹽堿水域養(yǎng)殖品種單一、缺乏優(yōu)質(zhì)魚類的情況，2003年本課題組將大鱗鲃從烏茲別克斯坦引入我國[2].2008年，江蘇省農(nóng)業(yè)科學院宿遷農(nóng)科所首次引進大鱗鲃，在蘇北淡水池塘養(yǎng)殖.大鱗鲃原種最初進行繁殖時，雌魚17尾，雄魚僅有3尾.養(yǎng)殖10年內(nèi)，大鱗鲃繁育群體的雌雄比例約為3∶1，在繁殖高峰期，常常出現(xiàn)雄魚數(shù)量不夠、精子成熟度較差的現(xiàn)象.精子活力與受精率有密切關(guān)系，在大鱗鲃雄魚精子數(shù)量不足的情況下，提高精子活力是得到高受精率的重要途徑[3-5].Na、K、葡萄糖等不僅是魚類精漿的重要成分，也是構(gòu)成精漿滲透壓的主要物質(zhì)[6]，它們也是魚類人工繁殖過程中精子保存液的主要成分.研究這些物質(zhì)對大鱗鲃精子活力的影響，對于提高其受精率和孵化率具有重要意義.

有關(guān)魚類精子活力的研究報道較多[7-11]，不同魚類的精子有不同的抑制與激活機制，這是魚類精子自身的生理特性以及環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果[12]，如不同科、屬的魚類對鹽度要求范圍差異較大[13].關(guān)于大鱗鲃精子生理活性方面的研究較少，僅見徐敏等[13]關(guān)于鈉鹽對精子活力影響的報道.然而，對精子活力影響的因素較多，除了電解質(zhì)，還有非電解質(zhì)因素.為此，本課題組研究了鈉鹽、鉀鹽和葡萄糖對大鱗鲃精子活力的影響，旨在探索保持大鱗鲃精子活力的最適宜鹽度范圍和營養(yǎng)需求.

1 材料與方法

1.1 親魚來源與精液采集

2017年5月份，在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院宿遷農(nóng)科所繁育基地，選取健康、體表鱗片完整的性成熟4齡大鱗鲃雄魚為親魚，平均體長為（46.97±2.53）cm，平均體質(zhì)量為（1.49±0.17）kg.每個實驗組有3尾魚，對其腹部注射一次催產(chǎn)劑.催產(chǎn)藥物為寧波生物制藥三廠生產(chǎn)的魚類催產(chǎn)激素，具體組分及每千克魚的劑量：促黃體釋放激素（LRH-A2）2 μg、馬來酸地歐酮（DOM）1 mg、絨毛膜促性腺激素（HCG）0.9 mg（200 IU）.注射了催產(chǎn)藥物的雄魚放入暫養(yǎng)桶中，水溫23～25℃，催產(chǎn)后10～14 h取精液.采精時，擦干魚的生殖孔，輕壓腹部，用1 mL注射器抽取精液，放入干燥離心管中（用潮濕紗布蓋上，以防精子失水）.抽取的精液呈乳白色，無血、尿、糞便和黏液污染.每個實驗重復(fù)3次，取平均值，檢測精子活力時稀釋液溫度為24～26℃.

1.2 方法

以去離子水為溶劑，分別配制NaCl、KCl和葡萄糖（均為分析純級）溶液，質(zhì)量濃度分別為 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/L.按照精液與鹽溶液體積比為 1 ∶200進行混合，取20 μL精子混合液滴入載玻片上，使用10×10倍顯微鏡觀察，以一個視野為準.精子活力等級的劃分依據(jù)文獻[14]，略加改進.從精液與稀釋液相混合開始計時，精子呈“漩渦”狀運動，約100%的精子被激活時為精子激烈運動時間；約70%的精子（分路運動）轉(zhuǎn)入中速運動時為精子快速運動時間；約95%的精子停止運動時為精子壽命終止時間.

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl對精子活力的影響

不同質(zhì)量濃度的NaCl溶液中大鱗鲃精子的活力如表1所示.

表1 不同質(zhì)量濃度的NaCl溶液中大鱗鲃的精子活力Tab.1 Sperm motility of Barbus capito in NaCl solutions with different mass concentrations s

由表1可以看出，隨著溶液中NaCl質(zhì)量濃度的增加，大鱗鲃精子的激烈運動時間（約100%的精子被激活，呈“漩渦”狀運動）、快速運動時間（約70%的精子分路運動）和壽命（約5%的精子原地顫動）均先增加，在NaCl質(zhì)量濃度為5 g/L時達到最大值，快速運動時間為（52.5±4.2）s，壽命達到（92.5±3.3）s.隨著NaCl質(zhì)量濃度的進一步增加，精子活力下降.鹽度為8 g/L時，精子快速運動時間僅有（9.2±1.6）s，為峰值的17.5%，壽命為（26.6±2.6）s，為峰值的 28.8%.NaCl質(zhì)量濃度達到9 g/L時，精子只是原地顫動，加入去離子水后又開始運動，即該質(zhì)量濃度的NaCl溶液可以用于保存大鱗鲃精子；NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L時，精子很快死亡，即使再加去離子水，精子也不被激活.由此可知，NaCl溶液的質(zhì)量濃度為5 g/L時，大鱗鲃精子活力最高.

2.2 KCl對精子活力的影響

不同質(zhì)量濃度的KCl溶液中大鱗鲃精子的活力如表2所示.

表2 不同質(zhì)量濃度的KCl溶液中大鱗鲃的精子活力Tab.2 Sperm motility of Barbus capito in KCl solutions with different mass concentrations s

由表2可以看出，KCl質(zhì)量濃度為0～6 g/L時，大鱗鲃精子活力隨著KCl質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢，當KCl質(zhì)量濃度為6 g/L時，精子的激烈運動時間、快速運動時間和壽命均最長.隨著KCl質(zhì)量濃度的進一步增加，大鱗鲃精子活力下降.KCl質(zhì)量濃度為9 g/L時，精子原地顫動，加去離子水后精子被激活，即該質(zhì)量濃度的KCl溶液也可用于大鱗鲃精子的保存；KCl質(zhì)量濃度為10 g/L時，加去離子水精子未被激活，說明精子已死亡.由此認為，KCl質(zhì)量濃度為6 g/L時大鱗鲃精子的活力最大.

與NaCl溶液相比，KCl溶液中大鱗鲃精子的激烈運動時間略低，其最大值略低于NaCl溶液中的數(shù)值，但是精子的快速運動時間和壽命均高于NaCl溶液中的數(shù)值，尤其是壽命，最大值達到了（309.6±16.0）s，而NaCl溶液中的精子最長壽命僅為（92.5±3.3）s.魚類受精過程中，只有70%快速運動的精子可以穿過卵膜，具有與卵結(jié)合的能力，因此認為，KCl溶液更適合于激活大鱗鲃精子.

2.3 葡萄糖對精子活力的影響

不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液中大鱗鲃精子的活力如表3所示.

表3 不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液中大鱗鲃的精子活力Tab.3 Sperm motility of Barbus capito in glucose solutions with different mass concentrations s

由表3可以看出，葡萄糖質(zhì)量濃度為0～5 g/L時，大鱗鲃精子活力隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加，在5 g/L時，精子的激烈運動時間、快速運動時間和壽命均達到最大，分別為（26.4±1.3）s、（33.2±2.6）s和（55.4±1.8）s.葡萄糖質(zhì)量濃度進一步增加，精子活力下降.由此可見，葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度為5 g/L時最有利于大鱗鲃精子活動.總之，大鱗鲃精子在不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液中，活力的變化幅度明顯小于在NaCl或KCl溶液中的數(shù)值，即葡萄糖對大鱗鲃精子活力的影響小于NaCl和KCl.

3 討論與結(jié)論

對淡水魚類而言，滲透壓是影響魚類存活的主要因素，也是精子維持活力的主要因素，魚類大部分能量消耗在滲透壓調(diào)節(jié)上[11-12].若精子處于等滲環(huán)境中，原來用于調(diào)節(jié)滲透壓的能量可轉(zhuǎn)用于維持其活動，活動時間必將延長.本研究配制的質(zhì)量濃度為5 g/L的NaCl溶液，其滲透壓接近嚴安生等[11]研究發(fā)現(xiàn)的淡水魚類精子原生質(zhì)的滲透壓（170 kPa），在此環(huán)境下大鱗鲃精子的激烈運動時間、快速運動時間和壽命均達到最大.在魚類繁殖過程中，延長精子快速運動時間能夠為精子與卵子相遇贏得更多機會，從而提高受精率.

Na+、K+是精漿的重要組分和形成精漿滲透壓的主要離子.通常情況下，魚類精子在精巢中是不運動的，但具有潛在運動能力[13].鹽度通過離子作用和滲透壓調(diào)節(jié)并影響cAMP-ATP-Mg2+系統(tǒng)的運行，進而影響精子鞭毛的活動[15-17].在鹽度相對較低的溶液中，精子內(nèi)ATP的產(chǎn)生和消耗在一段時間內(nèi)可達到平衡，因此精子能夠維持較長壽命；而高鹽濃度的溶液中，ATP酶活性被抑制，從而使精子活力下降[18].本研究中，大鱗鲃精子在NaCl質(zhì)量濃度為0～5 g/L或KCl質(zhì)量濃度為0～6g/L的溶液中時，精子活力隨鹽度的升高而升高，NaCl或KCl的質(zhì)量濃度為3～6 g/L時，精子快速運動時間和壽命較長，為最適鹽度范圍；溶液中NaCl或KCl的質(zhì)量濃度大于8 g/L時，精子活力明顯降低，達到9 g/L時，大鱗鲃精子開始停止運動，但一旦加入去離子水后，精子又開始快速運動，因此可在此鹽度下保存大鱗鲃精子；當NaCl或KCl的質(zhì)量濃度超過10 g/L時，精子不再運動，即使加入去離子水，精子仍然不運動，說明精子此時已經(jīng)死亡.這可能是因為溶液與精子細胞質(zhì)中的滲透壓相差太大，精子自身的能量全部用于調(diào)節(jié)滲透壓，能量消耗殆盡以致死亡，也可能是由于滲透壓太大，直接導(dǎo)致精子的細胞結(jié)構(gòu)受損而死亡[19].本研究中NaCl的質(zhì)量濃度為5 g/L時大鱗鲃精子的快速運動時間和壽命最長，與徐敏等[13]的研究結(jié)果略有不同（NaCl最佳質(zhì)量濃度為4 g/L），這可能是由于實驗用大鱗鲃雄魚的年齡不同，本研究中為4齡魚，徐敏等的研究中為6齡魚.

本研究首次探究了KCl對大鱗鲃精子活力的影響，發(fā)現(xiàn)在6 g/L的KCl溶液中，精子的快速運動時間和壽命均長于其在5 g/L NaCl溶液中的數(shù)值，這與宋勇等[7]對彩鯽精子活力的研究結(jié)果相近.在海水魚類和某些鮭科魚類中，K+有抑制精子活力的作用[20-21]，然而在淡水魚類中，K+能增強鯉、歐鯽、花、雅羅魚、團頭魴等精子的活力，延長其壽命，并提高精子運動速度[22-23].Na+和K+對精子活力的影響因魚的種類而異，且存在較大差異，其機制有待進一步研究.

魚類精液中的碳水化合物主要是葡萄糖.體外受精魚類的精子具有三羧酸循環(huán)代謝的能力，魚類精子可以通過氧化作用利用細胞外源性化合物，尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖[8].嚴安生等[8，11]研究發(fā)現(xiàn)，鯉、團頭魴精子在葡萄糖溶液中的快速運動時間和壽命均長于其在NaCl或KCl溶液中的數(shù)值；宋勇等[7]發(fā)現(xiàn)，彩鯽精子在質(zhì)量濃度為1.5 g/L的葡萄糖溶液中時，精子壽命比最佳濃度的NaCl溶液中的壽命長約350 s.這些研究表明，葡萄糖這種延長精子存活時間的作用不僅與滲透壓調(diào)節(jié)有關(guān)，也與溶質(zhì)自身密切相關(guān)，即體外受精魚類的精子具有利用細胞外源性單糖來補償自身能量消耗的能力.本研究中，大鱗鲃精子活力在不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液中的變動幅度小于無機鹽溶液，說明葡萄糖對大鱗鲃精子活力的影響弱于無機鹽.在5 g/L的葡萄糖溶液中精子快速運動時間和壽命最長，但數(shù)值低于其在NaCl或KCl溶液中的最大值，具體機制有待進一步探討.