擬南芥AFP4的克隆、原核表達(dá)和純化及其與ABI5的互作

鄧子兵，邱梁堃，馬建忠

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730050)

脫落酸(abscisic acid，ABA)是植物響應(yīng)生物與非生物脅迫的一個(gè)重要的激素，參與種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、種子成熟等生理過(guò)程[1-2]。擬南芥ABI5亞家族轉(zhuǎn)錄因子參與了植物種子晚期胚胎發(fā)育、種子萌發(fā)和生長(zhǎng)，以及ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[3-11]。然而在隨后的研究過(guò)程中，Lopez-Molina等[12]利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選了與ABI5相互作用的蛋白AFP。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，AFP的表達(dá)特性與ABI5相似，在種子萌發(fā)期間受ABA誘導(dǎo)[13]。afp的突變體植株對(duì)ABA超敏感，而AFP超表達(dá)植株對(duì)ABA產(chǎn)生低抗性[13]。

AFPs與共抑制物TOPLESS相互作用，以抑制ABA調(diào)節(jié)的基因表達(dá)[13]。AFP的水稻同系物MODD(OsbZIP46失活和降解的調(diào)節(jié)劑)通過(guò)與TPR/HAD復(fù)合物和OsbZIP46(與擬南芥最接近的同源物)的相互作用而負(fù)調(diào)節(jié)ABA反應(yīng)ABF1，導(dǎo)致OsbZIP46靶基因的組蛋白乙?；瘻p少[14]。MODD還與E3連接酶相互作用，導(dǎo)致OsbZIP46的穩(wěn)定性降低。這些相互作用的組合效應(yīng)是減弱ABA響應(yīng)，類似于擬南芥中的AFP的作用[14]。AFP部分通過(guò)組蛋白乙?；母淖円种艫BA/ABI5調(diào)控的基因的表達(dá)。在低濃度的ABA下，AFP1和AFP2與ABI5蛋白的比率最高，這些蛋白質(zhì)在反饋環(huán)中起作用，以允許幼苗從ABA抑制生長(zhǎng)中逃脫[2]。

到目前為止，對(duì)AFPs的研究大多局限于植物中的時(shí)空表達(dá)、ABA脅迫影響、突變體表型分析等方面。以AFP4為代表克隆其基因的完整編碼序列，并表達(dá)純化其蛋白，是研究其與ABI5相互作用機(jī)理所必需的。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(ArabidopsisthalianaL.Columbia)的飽滿種子經(jīng)4 ℃春化后播種于營(yíng)養(yǎng)土(丹麥品氏基質(zhì)5號(hào)，pH 5.5)表面，放置于植物溫室(光照強(qiáng)度250 μmol·m-2·s-1，22 ℃，16 h光照，8 h黑暗，60%濕度)中培養(yǎng)。幼苗生長(zhǎng)2周后取蓮座葉片并提取基因組。

大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α菌株、EscherichiacoliBL21 Star (DE3)菌株、pET-32a(+)質(zhì)粒為蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院馬建忠研究員實(shí)驗(yàn)室保存。

所有限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR?HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)、DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SDS、IPTG、苯甲基磺酰氟(PMSF)、氨芐青霉素、瓊脂糖、溴化乙錠、丙烯酰胺、胰蛋白胨和酵母提取物等購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。Ni-NTAAgarose購(gòu)自Qiagen公司。Anti-HIS-antibody(D110002-0025)一抗和羊抗兔lgG二抗(ZB-2301)購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥基因組的提取

剪取2周齡擬南芥幼苗的蓮座葉100 mg，參照北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒和天根生化科技有限公司的植物RNA提取試劑盒進(jìn)行擬南芥基因組和RNA的提取。用超微量核酸蛋白測(cè)定儀(NanoDrop 2000)檢測(cè)其濃度后放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 擬南芥總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

剪取擬南芥的葉片或整株于1.5 mL EP管中，并將EP管置于液氮中，用RNA試劑盒(天根)提取總RNA。利用NanoDrop2000測(cè)定提取的RNA濃度，置于-80 ℃保存，或者直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用Invitrogen M-MLV試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入總RNA 1～5 μg·μL-1，100 μmol·L-1Oligo dT201 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，以ddH2O補(bǔ)足至29 μL，于冰上混合，65 ℃反應(yīng)5 min后，迅速取出冰浴10 min；再在管中加入5×first strand buffer 8 μL、0.1 mol·L-1DTT 2 μL、200 U·μL-1M-MLV 1 μL，并輕輕混勻，37 ℃反應(yīng)60 min后，于70 ℃放置15 min以終止反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄完成后，加入ddH2O稀釋cDNA濃度至20 ng·μL-1。

1.2.3AFP4基因CDS的擴(kuò)增及原核表達(dá)重組質(zhì)粒及酵母雙雜交重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中提供的AFP4基因序列(GenBank登錄號(hào)：NM_111081.2)分別設(shè)計(jì)特異性引物。原核表達(dá)重組質(zhì)粒上游引物F: 5′-ATGAATTCATGGAGATGATAAGAGGCAG-3′；下游引物R: 5′-CCGCTCGAGCTAGATAGAAGAAGA-AGGAAGTTTAAC-3′。酵母雙雜交重組質(zhì)粒上游引物F: 5′-ATGAATTCATGGAGATGATAAGAGGCAG-3′；下游引物R: 5′-AACTGCAGCTAGATAGAAGAAGAAGGAAGTTTAAC-3′。特異性引物由江蘇金唯智生物科技有限公司合成。通過(guò)PCR擴(kuò)增并分別將PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ以及EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后分別與pET-32a(+)原核表達(dá)載體和酵母雙雜交載體pGBKT7連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定并送江蘇金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET-32a(+)-AFP4、pGBKT7-AFP4。

1.2.4ABI5基因CDS的擴(kuò)增酵母雙雜交重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中提供的ABI5基因序列(GenBank登錄號(hào)：NM_129185.3)設(shè)計(jì)特異性引物。酵母雙雜交重組質(zhì)粒上游引物F: 5′-ATGAATTCATGGTAACTAGAGAAACGAAGTTGACGT-3′；下游引物R: 5′-AACTGCAGTTAGAGTGGACAACTCGGGT-3′。特異性引物由江蘇金唯智生物科技有限公司合成。通過(guò)PCR擴(kuò)增并分別將PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后與酵母雙雜交載體pGADT7連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定并送江蘇金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pGADT7-ABI5。

1.2.5 AFP4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

(1)IPTG誘導(dǎo)濃度的選擇。將上述測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-AFP4轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coliBL21 Star (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取一個(gè)陽(yáng)性單克隆接種于3 mL含60 μg·mL-1氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日按1∶100轉(zhuǎn)接于20 mL含60 μg·mL-1氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至D600為0.5～0.7，取1 mL菌液留做SDS-PAGE分析，然后分別加入IPTG，使其終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mmol·L-1，30 ℃、150 r·min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。分別稀釋至相同D值后取1 mL菌液12 000 r·min-1離心2 min，收集菌體，隨后用12% SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白表達(dá)量的分析。

(2)誘導(dǎo)時(shí)間的選擇。挑取一個(gè)陽(yáng)性單克隆接種于3 mL含60 μg·mL-1氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日按1∶100轉(zhuǎn)接于300 mL含60 μg·mL-1氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至D600為0.5～0.7，取1 mL菌液留做SDS-PAGE分析，然后分別加入IPTG使其終濃度為0.4 mmol·L-1。30 ℃、150 r·min-1進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。分別在1、2、4、6、8 h進(jìn)行取樣，稀釋至同一D值后取1 mL菌液12 000 r·min-1離心2 min，收集菌體，隨后用12% SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白表達(dá)量的分析?？蛰d的pET-32a(+)載體用相同的方法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

(3)誘導(dǎo)溫度的選擇。挑取一個(gè)陽(yáng)性單克隆接種于3 mL含60 μg·mL-1氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日按1∶100轉(zhuǎn)接于20 mL含60 μg·mL-1氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至D600為0.5～0.7，取1 mL菌液留做SDS-PAGE分析，然后分別加入IPTG使其終濃度為0.4 mmol·L-1。分別于20、25、30、35 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，稀釋至同一D值后取1 mL菌液12 000 r·min-1離心2 min，收集菌體，隨后用12% SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白表達(dá)量的分析。

1.2.6 融合蛋白的純化

將經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的100 mL菌液經(jīng)4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min后收集菌體沉淀。之后用4 mL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液(20 mmol·L-1NaH2PO4，20 mmol·L-1Na2HPO4，500 mmol·L-1NaCl，pH 7.4)重懸沉淀并加入PMSF至終濃度為1 mmol·L-1。冰浴30 min后用超聲波破碎儀裂解菌體(JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，功率320 W，冰浴下超聲4 s，間隔2 s，99個(gè)循環(huán))。4 ℃、10 000 r·min-1離心30 min收集上清并經(jīng)0.4 μm濾膜過(guò)濾后用于Ni-NTA親和層析柱純化。2 mL Ni-NTA層析柱以6倍柱體積的平衡緩沖液(20 mmol·L-1NaH2PO4，20 mmol·L-1Na2HPO4，500 mmol·L-1NaCl，pH 7.8)平衡后進(jìn)行上樣。上樣后，用約40 mL洗滌緩沖液(20 mmol·L-1NaH2PO4，20 mmol·L-1Na2HPO4，500 mmol·L-1NaCl，pH 6.0，流速18 mL·h-1)洗滌層析柱，直至流出液體的D280小于0.01。之后依次用10 mL含10、50、100、150、200 mmol·L-1咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。分管收集洗脫液，測(cè)定D280，用SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純度。

1.2.7 Western blot分析

按照文獻(xiàn)[15]將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白Marker及目的蛋白的位置將剝離的凝膠進(jìn)行裁剪，根據(jù)戎芳等[16]的方法進(jìn)行Western blot分析。Anti-HIS-antibody(D110002-0025)一抗用TTBS稀釋至5 μg·mL-1。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔lgG二抗(ZB-2301)用TTBS稀釋至10 ng·mL-1。

1.2.8 酵母雙雜交驗(yàn)證AFP4與ABI5的相互作用

(1)酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備。從YPDA固體培養(yǎng)基表面選擇年齡為2周左右、直徑為3 mm左右的酵母AH109單菌落，并將其接種于0.5 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，渦旋振蕩約3 min以分散聚集在一起的酵母細(xì)胞，然后將其全部接種于10 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)約18 h，直到菌體D600值達(dá)到1.5以上。將過(guò)夜培養(yǎng)物接種于250 mL YPDA液體培養(yǎng)基中并使初始菌體D600值為0.2～0.3，30 ℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)約4 h，直到菌體D600值為0.4～0.6。1 000g、室溫離心5 min，小心倒掉上清，加入20 mL 1×TE/LiAc 溶液重懸酵母細(xì)胞，1 000g、室溫離心5 min，小心倒掉上清，再重復(fù)一次。向沉淀的酵母細(xì)胞中加入約3 mL 1×TE/LiAc溶液并輕輕懸起細(xì)胞，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞，可將感受態(tài)細(xì)胞封存于4 ℃冰箱或冰浴中，保存最長(zhǎng)時(shí)間約為4 h。

(2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞。吸取0.1 μg重組質(zhì)粒于1.5 mL滅菌離心管中，再加入10 μL鮭魚(yú)精子DNA(Sperm DNA，10 mg·mL-1)，用移液器反復(fù)吹打混勻，酵母感受態(tài)細(xì)胞緩緩顛倒混勻，分別吸取100 μL加入到上述離心管中，并用移液器緩慢吹打混勻。每個(gè)離心管加入600 μL 1×PEG/LiAc，渦旋振蕩混勻，30 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)40 min，各加入70 μL 100% DMSO，緩慢顛倒混勻后，置于42 ℃水浴保溫15 min，迅速放入冰浴冷卻2 min。12 000 r·min-1、室溫離心30 s，輕輕吸取上清，再在每管中加入500 μL 1×TE并吹打混勻，吸取100 μL懸浮液均勻涂布于SD/-Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基表面，待表面的液體揮發(fā)后，于30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)4～6 d，直至長(zhǎng)出的菌落直徑約為3 mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥基因組的提取以及AFP4原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以提取的擬南芥基因組為模板，采用特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得AFP4整個(gè)編碼序列(圖1-A)，分別將pET-32a(+)載體和PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coliDH5α，陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定(圖1-B)，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)有一條大約1 000 bp的條帶(圖1-C)，隨后進(jìn)行測(cè)序。

2.2 AFP4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

AFP4編碼序列插入pET-32a(+)表達(dá)載體中后形成一個(gè)可編碼486個(gè)氨基酸殘基的開(kāi)放閱讀框，經(jīng)計(jì)算，該融合蛋白的分子量為53.4 ku(圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1時(shí)融合蛋白含量占上清總蛋白含量比例最高，為24.3%(圖3-A)。用終濃度為0.4 mmol·L-1的IPTG同時(shí)誘導(dǎo)空載載體和融合載體，經(jīng)過(guò)不同的時(shí)間誘導(dǎo)后，經(jīng)BandScan 5.0軟件掃描分析SDS-PAGE電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)空載載體只有一條大約23 ku的小條帶，而誘導(dǎo)6 h時(shí)融合蛋白質(zhì)含量占上清總蛋白含量比例最大，為40.1%(圖3-C)。在前兩個(gè)參數(shù)(IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究不同溫度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明，25 ℃時(shí)融合蛋白質(zhì)含量占上清總蛋白含量比例最大，為41.6%(圖3-D)。

A: AFP4編碼區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M，DL2000 DNA marker；1，AFP4 PCR產(chǎn)物。B: AFP4菌落PCR鑒定。M，DL2000 DNA marker；1，AFP4菌落PCR鑒定。C：雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，M，DL2000 DNA Marker；1，重組質(zhì)粒酶切鑒定。A: PCR amplification products in coding region of AFP4.M，DL2000 DNA marker; 1，PCR amplification products of AFP4.B: PCR identification of colony of AFP4.M，DL2000 DNA marker; 1，PCR identification of colony of AFP4.C: Double enzyme digestion for identification of recombinant plasmids.M，DL2000 DNA marker; 1，Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion.圖1 AFP4擴(kuò)增、PCR鑒定及雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 PCR amplification，detection and double enzyme identification of AFP4

2.3 AFP4重組蛋白的純化及Western blot鑒定分析

100 mL菌液在IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1、25 ℃下誘導(dǎo)6 h后超聲裂解，上清液加載至Ni-NTA親和層析柱，洗滌緩沖液洗滌之后，以含不同咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白條帶在咪唑濃度為150 mmol·L-1時(shí)可被洗脫。SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后的蛋白為一條清晰的條帶。BandScan 5.0軟件掃描樣品泳道后顯示，該條帶的蛋白含量可占到上樣成分的86.9%(圖4-A)。為了更進(jìn)一步確定該條帶是否為含AFP4的融合蛋白，經(jīng)Western Blot分析，結(jié)果表明上述純化的蛋白含有6×His標(biāo)簽肽(圖4-B)。

圖2 AFP4重組融合蛋白結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Fusion protein structure of AFP4

A：不同IPTG濃度誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)量。M，Premixed protein marker (Low)；1，pET-32a(+)誘導(dǎo)前；2，pET-32a(+)誘導(dǎo)后；3，pET-32a(+)-AFP4誘導(dǎo)前；4～9，當(dāng)IPTG濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmoL·L-1時(shí)誘導(dǎo)含pET-32a(+)-AFP4的大腸埃希菌4 h的蛋白表達(dá)量；B：pET-32a(+)空載誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量。M，Premixed protein marker (Low)；1，pET-32a(+)誘導(dǎo)前；2～6，當(dāng)IPTG濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmoL·L-1時(shí)誘導(dǎo)含pET-32a(+)的大腸埃希菌蛋白的表達(dá)量。C：不同誘導(dǎo)時(shí)間融合蛋白的表達(dá)量。M，Premixed protein marker (Low)；1，pET-32a(+)-AFP4誘導(dǎo)前；2～6，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間分別為1、2、4、6、8 h時(shí)誘導(dǎo)含pET-32a(+)-AFP4的大腸埃希菌蛋白的表達(dá)量。D：不同誘導(dǎo)溫度融合蛋白的表達(dá)量。M，Premixed protein marker (Low)；1，pET-32a(+)誘導(dǎo)前；2～5，當(dāng)誘導(dǎo)溫度分別為35、30、25、20 ℃時(shí)誘導(dǎo)含pET-32a(+)的大腸埃希菌蛋白的表達(dá)量。A: Expression of fusion protein induced by different IPTG concentration.M，Premixed protein marker (Low); 1，Before induction of pET-32a(+); 2，After induction of pET-32a(+); 3，Before induction of pET-32a(+)-AFP4; 4-9，Protein expression of Escherichia coli 4 h containing pET-32a (+)-AFP4 was induced when the concentrations of IPTG was 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 mmoL·L-1.B: PET-32a (+) no load induced protein expression.M，Premixed protein marker (Low); 1，Before induction of pET-32a(+); 2-6，Expression of Escherichia coli protein containing pET-32a (+) was induced when the concentrations of IPTG was 0.1，0.2，0.4，0.6 and 0.8 mmoL·L-1.C: Expression of fusion protein at different induction time.M，Premixed protein marker (Low); 1，Before induction of pET-32a(+)-AFP4; 2-6，Expression of Escherichia coli protein containing pET-32a(+)-AFP4 was induced when the induction time was 1，2，4，6 and 8 h.D: Expression of fusion protein at different induction temperatures.M，Premixed protein marker (Low); 1，Before induction of pET-32a(+); 2-5，Expression of Escherichia coli protein containing pET-32a (+) was induced when the induction temperature was 35，30，25 and 20 ℃.圖3 不同參數(shù)誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)量Fig.3 Expression quantity of induced fusion protein under different conditions

2.4 酵母雙雜交驗(yàn)證AFP4與ABI5相互作用結(jié)果

將質(zhì)粒按照表1的順序共同轉(zhuǎn)化至釀酒酵母AH109中，并涂布于SD-Leu/Trp固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～4 d。挑2 mm左右的單菌落于3 mL SD-Leu/Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r·min-1過(guò)夜培養(yǎng)。次日用微量移液器將培養(yǎng)物分別點(diǎn)在SD-Leu/-Trp，SD-Leu/-Trp/-His/-Ade，SD-Leu/-Trp/-His/-Ade X-α-Gal固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～4 d。

A: SDS-PAGE電泳。M，Premixed protein marker (Low)；1，pET-32a(+)誘導(dǎo)前；2，pET-32a(+)誘導(dǎo)后；3，pET-32a(+)-AFP4誘導(dǎo)前；4，pET-32a(+)-AFP4誘導(dǎo)后；5，Ni-NTA親和層析柱純化后。B: Western blot鑒定結(jié)果。A: SDS-PAGE.M，Premixed protein marker (Low); 1，Before induction of pET-32a(+); 2，After induction of pET-32a(+); 3，Before induction of pET-32a(+)-AFP4; 4，After induction of pET-32a(+)-AFP4; 5，After purification with Ni-NTA affinity chromatography column.B: Identification result of Western blot.圖4 重組蛋白的純化以及Western blot鑒定結(jié)果Fig.4 Purification of recombinant proteins and identification results of Western blot

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AFP4融合蛋白在大腸埃希菌E.coliBL21 Star (DE3)中的表達(dá)是非常強(qiáng)烈的，可能歸因于大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、細(xì)胞生長(zhǎng)迅速、目的基因表達(dá)水平較高、培養(yǎng)成本低、培養(yǎng)周期短等特點(diǎn)[17]。然而外源目的基因的表達(dá)量也受到菌體生長(zhǎng)狀況、誘導(dǎo)溫度、時(shí)間以及誘導(dǎo)劑的濃度等因素的影響[18]。由于本實(shí)驗(yàn)的目的融合蛋白不是大批量生產(chǎn)，不需要通過(guò)正交分析確定最優(yōu)的工藝條件。在IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1、25 ℃下誘導(dǎo)6 h之后的培養(yǎng)物中，目的蛋白的表達(dá)量占上清液總蛋白的41.6%。在經(jīng)不同IPTG濃度誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)的過(guò)程中，經(jīng)0.8 mmol·L-1誘導(dǎo)時(shí)重組蛋白含量有所降低，這極有可能是操作過(guò)程中產(chǎn)生的誤差。

經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后，雖然為一條清晰的條帶，但是其前面有一條微弱的條帶以及彌散雜帶，有可能是純化過(guò)程中條件不成熟造成的非特異性蛋白質(zhì)或目的蛋白降解。將誘導(dǎo)之后的目的蛋白質(zhì)條帶和純化后的蛋白質(zhì)條帶經(jīng)Western blot鑒定分析，結(jié)果證實(shí)了上述表達(dá)以及純化的蛋白是AFP4重組蛋白。然而對(duì)于上述幾個(gè)問(wèn)題形成的原因仍有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

表1 共轉(zhuǎn)質(zhì)粒信息表

A，SD-Leu/-Trp生長(zhǎng)結(jié)果；B，SD-Leu/-Trp/-His/Ade生長(zhǎng)結(jié)果；C，SD-Leu/-Trp/-His/Ade X-α-Gal顯色結(jié)果。A，Growth results of SD-Leu/-Trp; B，Growth results of SD-Leu/-Trp/-His/Ade; C，Chromogenic results of SD-Leu/-Trp/-His/Ade X-α-Gal.圖5 酵母雙雜交鑒定結(jié)果Fig.5 Analysis of yeast two-hybrid

酵母雙雜交系統(tǒng)最早是由美國(guó)科學(xué)家Fields等[19]于1989年提出的，由于其遺傳背景簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、技術(shù)成熟等，已經(jīng)廣泛被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的驗(yàn)證、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、功能基因組學(xué)研究等工作[20-23]，在研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用、文庫(kù)篩選、篩選新的多肽藥物、研究基因和蛋白質(zhì)的功能等方面發(fā)揮了重要作用[20]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)不斷改進(jìn)建立了酵母單雜交系統(tǒng)[21]、酵母三雜交系統(tǒng)[22]以及反向雙雜交系統(tǒng)[23]。酵母雙雜交及其衍生系統(tǒng)在生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的不斷擴(kuò)大，為我們展示了一個(gè)獲得生物體內(nèi)蛋白質(zhì)之間紛繁復(fù)雜作用關(guān)系的有效途徑。隨著酵母雙雜交系統(tǒng)的不斷改進(jìn)與完善，酵母雙雜交及其相關(guān)技術(shù)將得到更廣泛的應(yīng)用，在蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤基因表達(dá)，以及植物激素信號(hào)通路等領(lǐng)域的研究中將發(fā)揮巨大的作用。

致謝：本實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果是在蘭州大學(xué)細(xì)胞活動(dòng)與逆境適應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝黎家教授、茍小平教授、何凱教授，以及肖成斌等各位師兄師姐的支持與幫助。