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    花生紅衣水提物對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用*

    2018-12-28 06:14:12麗文
    關(guān)鍵詞:巴比妥鈉紅衣水提物

    麗文

    (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,濟(jì)寧 272067)

    隨著社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,生活節(jié)奏的日益加快,失眠的發(fā)病率逐年攀升,嚴(yán)重危害人類的身心健康,失眠已成為嚴(yán)重的社會和醫(yī)學(xué)問題。目前臨床上治療失眠的藥物主要是苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥,但長期服用這些藥物不僅會產(chǎn)生頭昏、乏力等副作用,而且可產(chǎn)生明顯的耐受性、依賴性和“日間宿醉反應(yīng)”。純植物提取物在改善睡眠方面有著獨(dú)特優(yōu)勢,具有毒副作用小,無成癮性等特點(diǎn),是目前研究鎮(zhèn)靜催眠藥物的新方向。花生莖葉提取物有鎮(zhèn)靜催眠作用[1-2],花生葉水煎液(落花安神合劑)已應(yīng)用于臨床且療效顯著[3]?;ㄉt衣(花生的種皮)具有抗氧化、抗過敏、降血糖、降血脂、止血等藥理作用[4],但目前國內(nèi)外對其鎮(zhèn)靜催眠作用研究尚未見報(bào)道。本文通過對小鼠自主活動、協(xié)同戊巴比妥鈉催眠作用以及小鼠腦組織中GABA含量變化的研究,初步探討花生紅衣水提物的鎮(zhèn)靜催眠作用及作用機(jī)制,為進(jìn)一步開發(fā)利用花生紅衣提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

    1 材料

    1.1 動物

    昆明種小鼠,雄性,體重(20±2.0)g,由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物管理均遵循國家實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理?xiàng)l件和使用指南以及濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l件。

    1.2 藥物與試劑

    花生紅衣,購于濟(jì)寧廣聯(lián)藥店中藥房;地西泮注射液(湖北制藥廠,批號:971101);戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司,批號:F20021216);GABA試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司,批號:201505221922)。

    1.3 儀器

    HH-SJ數(shù)顯恒溫磁力攪拌油浴鍋(金壇市友聯(lián)儀器研究所);電子天平(北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司);ACS-30型電子計(jì)價(jià)秤(武義縣金宇衡器有限公司);ZZ-6小鼠自主活動測試儀(成都泰盟科技有限公司);Thermo MK3酶標(biāo)儀(上海賽默科技生物發(fā)展有限公司)。

    2 方法

    2.1 花生紅衣水提物的制備[5]

    取花生紅衣生500g,加入12倍量的蒸餾水,100℃回流 2 次,每次2h,過濾,合并兩次濾液,用蒸發(fā)皿蒸發(fā)濃縮成干浸膏,加生理鹽水配成濃度為1250、625、312.5mg/kg 的花生紅衣水提物備用。

    2.2 花生紅衣水提物對小鼠自主活動的影響

    取50只小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分成5組:空白對照組、地西泮陽性對照組(2mg/kg)、花生紅衣水提物高、中、低劑量組(1250mg/kg、625 mg/kg、312.5mg/kg),每組10只?;ㄉt衣各劑量組每只小鼠每日灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物,給藥容積為0.2ml/10g,空白對照組給予等體積生理鹽水,1次/d,連續(xù)給藥7d。地西泮陽性對照組灌胃等體積生理鹽水,連續(xù)6d,第7天時(shí)一次性灌胃給予2mg/kg地西泮,給藥容積為0.2ml/10g。

    小鼠末次給藥30min后,將各組小鼠放置于自主活動記錄儀中,先適應(yīng)10min,再開始記錄,記錄各組小鼠5min內(nèi)的自主活動次數(shù)。

    2.3 戊巴比妥鈉閾下和閾上睡眠劑量測定

    2.3.1閾下劑量[6]取50只小鼠,隨機(jī)分為5組,每組10只。各給藥組分別腹腔注射戊巴比妥鈉27、28、29、30mg/kg,空白對照組注射相同容量的生理鹽水。記錄15min內(nèi)翻正反射消失超過1min的小鼠數(shù)量,并使之作為入睡指標(biāo)。

    2.3.2閾上劑量[6]取小鼠50只,隨機(jī)分為5組,每組10只。各給藥組分別腹腔注射戊巴比妥鈉32、35、40、45 mg/kg,空白對照組注射等容量的生理鹽水。記錄15min內(nèi)翻正反射消失超過1min的小鼠數(shù)量,并使之作為入睡指標(biāo)。

    2.3.3判斷指標(biāo)[7]翻正反射消失:小鼠四肢朝上仰臥1min內(nèi)沒有翻轉(zhuǎn)過來,說明已進(jìn)入翻正反射消失階段。

    翻正反射恢復(fù):小鼠可以自由翻轉(zhuǎn)并且1min內(nèi)不再翻轉(zhuǎn)不過去,說明翻正反射恢復(fù)。

    入睡潛伏期:從注射藥物開始到翻正反射消失之間所用的時(shí)間。

    睡眠時(shí)間:從翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)所用的時(shí)間。

    2.4 花生紅衣水提物對閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠入睡率的影響

    動物分組、灌胃給藥方法同“2.2”,各組小鼠按照相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃7d。并在末次給藥后30min,給各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉閾下劑量29 mg/kg,給藥體積為0.1ml/10g。觀察并記錄給藥后15min內(nèi)各組小鼠的入睡情況并記錄各組小鼠的入睡只數(shù),以翻正反射消失>1min為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算各組小鼠睡眠發(fā)生百分率(入睡率)。

    入睡率(% )=入睡動物數(shù)/動物總數(shù)×100%

    2.5 花生紅衣水提物對閾上劑量戊巴比妥鈉小鼠入睡潛伏期和睡眠時(shí)間的影響

    動物分組、灌胃給藥方法同“2.2”,各組小鼠按照相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃7d。于末次給藥30min后,給各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉閾上劑量40 mg/kg,給藥體積為0.1 ml/10g。觀察并記錄各組小鼠的入睡潛伏期及睡眠持續(xù)時(shí)間。

    2.6 小鼠腦組織內(nèi)GABA含量測定

    末次藥后30 min,脫臼處死小鼠,取出大腦,冰冷生理鹽水沖洗,濾紙吸干,稱重,勻漿機(jī)勻漿,3000 r/min離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書,采用ELISA法測定GABA含量。

    2.7 臟器系數(shù)[8]

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各小組小鼠脫臼處死前稱體重,解剖取出其心、肝、脾、肺、腎組織,除去上述器官周圍脂肪結(jié)締組織,用濾紙吸干臟器表面血液后稱重,并計(jì)算臟器系數(shù):臟器濕重(mg)/體重(g)

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3 結(jié)果

    3.1 花生紅衣水提物對小鼠自主活動的影響

    與空白對照組比較,地西泮陽性對照組和花生紅衣低劑量組均可顯著減少小鼠5min內(nèi)的自主活動次數(shù)和站立次數(shù)(P<0.05),表明花生紅衣水提物具有抑制小鼠的自主活動的作用。紅衣水提物3劑量組之間不存在量效關(guān)系。見表1。

    表1 花生紅衣水提物對小鼠自主活動的影響

    注:與空白對照組比較,*P<0.05;與地西泮陽性對照組比較,#P>0.05。

    3.2 戊巴比妥鈉閾下、閾上睡眠劑量

    戊巴比妥鈉27 mg/kg、28 mg/kg小鼠入睡率為0%;29 mg/kg小鼠入睡率為10%;30、32、35 mg/kg小鼠入睡率分別為20%、30%、90%;40 mg/kg和45 mg/kg小鼠入睡率100%。因此,戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量確定為29 mg/kg,閾上睡眠劑量確定為40 mg/kg。見表2。

    表2 不同濃度戊巴比妥鈉對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用

    3.3 花生紅衣水提物對閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠催眠作用的影響

    與空白對照組相比,地西泮陽性對照組和花生紅衣水提物低劑量組小鼠入睡率明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而花生紅衣水提物高、中劑量組小鼠入睡率無顯著增加。提示花生紅衣低劑量組與戊巴比妥鈉閾下劑量具有協(xié)同作用,可提高小鼠入睡率。紅衣水提物3劑量組之間不存在量效關(guān)系。見表3。

    表3 閾下劑量小鼠入睡只數(shù)及入睡率

    注:與空白對照組比較,*P<0.05;與地西泮陽性對照組比較,#P>0.05。

    3.4 花生紅衣水提物對閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠催眠作用的影響

    與空白對照組相比,花生紅衣水提物高、中劑量組雖可縮短小鼠睡眠潛伏期并且延長小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間,但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);花生紅衣水提物低劑量組和地西泮陽性對照組均可縮短小鼠入睡潛伏期并且延長小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間,差異顯著(P<0.05)。紅衣水提物3劑量組之間不存在量效關(guān)系。見表4。

    表4 閾上劑量小鼠入睡潛伏期及睡眠時(shí)間

    注:與空白對照組比較,*P<0.05;與地西泮陽性對照組比較,#P>0.05;與空白對照組比較,**P>0.05。

    3.5 花生紅衣水提物對小鼠腦內(nèi)GABA含量影響

    與空白對照組相比,花生紅衣水提物高劑量組雖可升高小鼠腦內(nèi)GABA含量,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);但地西泮陽性對照組、花生紅衣水提物中、低劑量組小鼠腦內(nèi)GABA含量明顯升高,差異顯著(P<0.05)?;ㄉt衣水提物各劑量組之間無量效關(guān)系。見表5。

    表5 各組小鼠腦組織GABA含量比較

    注:與空白對照組比較 ,*P<0.05;與地西泮陽性對照組比較,#P>0.05;與空白對照比較,**P>0.05。

    3.6 花生紅衣水提物對小鼠臟器的影響

    花生紅衣水提物高劑量組脾臟系數(shù)與空白對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明花生紅衣水提物高劑量組對小鼠的脾臟可能有損傷作用。見表6。

    表6 各組小鼠臟器系數(shù)

    注:與空白對照組比較 ,*P<0.05;與地西泮陽性對照組比較,#P>0.05。

    4 討論

    花生莖葉已用于臨床治療失眠,但同屬落花生種屬的花生紅衣是否具有鎮(zhèn)靜安神作用,國內(nèi)外尚無相關(guān)研究報(bào)道。本文旨在初步探索花生紅衣的鎮(zhèn)靜催眠作用及可能的作用機(jī)制,為繼續(xù)尋找開發(fā)具有鎮(zhèn)靜催眠作用的純天然植物藥物奠定基礎(chǔ)。

    自發(fā)活動實(shí)驗(yàn)是評價(jià)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)的常用方法[9],動物的自發(fā)活動情況反映出中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài),中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮時(shí)動物活動次數(shù)增加,中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制時(shí),動物的自主活動減少。本文結(jié)果表明,與空白對照組相比,花生紅衣水提物低劑量組和地西泮陽性對照組小鼠的自發(fā)活動次數(shù)和站立次數(shù)均明顯減少(P<0.05),且花生紅衣水提物低劑量組和陽性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明低劑量花生紅衣水提物能顯著減少小鼠自主活動次數(shù),降低大腦皮層興奮性,具有一定的鎮(zhèn)靜作用。

    戊巴比妥鈉協(xié)同催眠實(shí)驗(yàn)是研究鎮(zhèn)靜催眠藥物催眠作用的常用實(shí)驗(yàn)之一[10]。戊巴比妥鈉是典型的中樞抑制藥,戊巴比妥鈉主要通過肝藥酶進(jìn)行代謝,因此對肝藥酶有抑制作用的藥物也能延長戊巴比妥鈉所致實(shí)驗(yàn)動物的睡眠時(shí)間,為排除此影響,采用了戊巴比妥鈉閾下劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[11],同時(shí)還通過閾上劑量戊巴比妥鈉實(shí)驗(yàn),觀察花生紅衣水提物對小鼠失眠情況的影響。本文結(jié)果表明,與空白對照組比較,花生紅衣水提物低劑量組和閾下劑量戊巴比妥鈉合用,可顯著增加小鼠入睡率;花生紅衣水提物低劑量組和閾上劑量戊巴比妥鈉合用,可明顯縮短小鼠入睡潛伏期及延長小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間,而且花生紅衣低劑量組和地西泮陽性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明花生紅衣水提物具有協(xié)同戊巴比妥鈉催眠作用。

    GABA 為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),可通過與 GABA受體(GABAA)結(jié)合,導(dǎo)致大量CL-內(nèi)流,引起細(xì)胞膜超極化使神經(jīng)元興奮性降低,發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,花生紅衣低劑量組可明顯提高小鼠腦組織中 GABA 含量,而且花生紅衣低劑量組和地西泮陽性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示花生紅衣水提物可能通過提高小鼠腦內(nèi)GABA水平發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用。

    心、肝、脾、肺、腎這些器官的重量變化,可以反映出動物體內(nèi)某些器官功能的變化。本文結(jié)果表明,與空白對照組相比,花生紅衣水提物高劑量組的脾臟系數(shù)明顯減少(P<0.05),表明花生紅衣水提物高劑量組可能對小鼠的脾臟有損害作用,花生紅衣中、低劑量組對小鼠的各個(gè)器官均無損傷作用。

    通過本研究,結(jié)果顯示花生紅衣水提物低劑量組鎮(zhèn)靜催眠效果較好且對動物臟器無損傷。并初步推測花生紅衣水提物升高小鼠腦內(nèi)GABA水平可能是其分子機(jī)制之一,但是否與腦內(nèi)其他神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)尚需進(jìn)一步探索、研究,另外其鎮(zhèn)靜催眠的具體有效成分還不明確,也有待我們研究、確定。

    我國花生產(chǎn)量世界第一,其用于榨油的副產(chǎn)品花生紅衣卻一直大量被棄置,若能將其開發(fā)利用為治療失眠的食品或藥品,必將具有良好的發(fā)展前景。

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