培養(yǎng)基質(zhì)量控制試驗適用性檢查方法研究

寧航忠

【摘要】目的：通過培養(yǎng)基適用性檢查實驗，證明培養(yǎng)基質(zhì)量是否符合要求，確保微生物檢查結(jié)果的準確性和可靠性。方法：按照《中國藥典》2015年版相關(guān)要求，采用6種試驗菌株和對照培養(yǎng)基進行試驗。結(jié)果：被檢計數(shù)培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落數(shù)平均數(shù)比值均在0.5～2范圍內(nèi)，控制菌檢查培養(yǎng)基符合檢出要求。結(jié)論：培養(yǎng)基適用性檢查實驗結(jié)果符合規(guī)定，培養(yǎng)基質(zhì)量符合要求。

【關(guān)鍵詞】 計數(shù)培養(yǎng)基 對照培養(yǎng)基 控制菌檢查培養(yǎng)基

培養(yǎng)基質(zhì)量是影響微生物檢驗結(jié)果的重要環(huán)節(jié)，微生物限度檢查用培養(yǎng)基主要分為需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)測定用培養(yǎng)基和控制菌檢查用培養(yǎng)基，《中國藥典》2015年版通則1105收載用于計數(shù)的培養(yǎng)基有：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基，用于控制菌大腸埃希菌檢查的培養(yǎng)基有：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基。適用性檢查是通過檢驗用培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基的比較，以陽性菌的生長狀態(tài)或特征來評價判斷檢驗用培養(yǎng)基是否符合檢驗要求。

1 儀器

超凈臺、生物安全柜、生化培養(yǎng)箱、立式滅菌器、恒溫電熱鼓風干燥箱、電子天平

2 培養(yǎng)基

（1）被檢培養(yǎng)基由廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基批號為3105545、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基批號為3105440、R2A瓊脂培養(yǎng)基批號為3105266、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基批號為3105291、麥康凱液體培養(yǎng)基批號為3105470

（2）對照培養(yǎng)基由中國食品藥品檢定研究所提供。

胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基批號為135025-201603、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基批號為135013-201502、R2A瓊脂對照培養(yǎng)基批號為135027-201401、麥康凱瓊脂對照培養(yǎng)基批號為135009-201503、麥康凱液體對照培養(yǎng)基批號為135030-201602

3 試驗菌株

試驗用菌株傳代次數(shù)不超過5代，由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供冷凍干燥菌種，為0代。

金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003）實驗室編號：JP-3-20161016-1、銅綠假單胞菌（CMCC（B）10104）實驗室編號：TL-3-20161016-1、枯草芽孢桿菌（CMCC（B）63501）實驗室編號：KC-3-20161016-1、大腸埃希菌（CMCC（B）44102）實驗室編號：DC-3-20161016-1、白色念珠菌（CMCC（F）98001）實驗室編號：BN-3-20161022-1、黑曲霉（CMCC（F）98003）實驗室編號：HQ-3-20161028-1。

4 試驗與結(jié)果

4.1 菌液制備

（1）接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)18～24小時。用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液，備用。

（2）接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于20～25℃培養(yǎng)48-72小時。用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液，備用。

（3）接種黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于20～25℃培養(yǎng)5～7天，或直到獲得豐富的孢子，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成制成適宜濃度的菌懸液，備用。

（4）、菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2～8℃，可在24小時內(nèi)使用，黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。

4.2 菌液計數(shù)

（1）、取銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌菌懸液各0.1ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌株平行制備2個平皿，輕輕搖勻凝固后，30～35℃培養(yǎng)不超過3天，觀察計數(shù)；

（2）、取白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液各0.1ml，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌株平行制備2個平皿，輕輕搖勻凝固后，20～25℃培養(yǎng)不超過5天，觀察計數(shù)。菌懸液計數(shù)結(jié)果如下：

銅綠假單胞菌：10-656CFU/ml、枯草芽孢桿菌：10-758CFU/ml、金黃色葡萄球菌：10-662CFU/ml、大腸埃希菌：10-750CFU/ml、白色念珠菌：10-544CFU/ml、黑曲霉菌：10-540CFU/ml。

4.3 培養(yǎng)基配制方法

按培養(yǎng)基使用說明配制胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基（被撿培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基），經(jīng)驗證合格的滅菌程序進行滅菌后備用。

4.4 無菌性檢查

取已滅菌的被撿培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基各注2個平皿，于30℃～35℃培養(yǎng)3～5天；麥康凱液體培養(yǎng)基2瓶，于42℃～44℃培養(yǎng)不少于3天；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基注2個平皿，20℃～25℃培養(yǎng)5～7天。各培養(yǎng)基均應(yīng)無菌落生長。

經(jīng)過規(guī)定時間培養(yǎng)，上述被撿培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基均為陰性。證明各培養(yǎng)基在規(guī)定時間內(nèi)均無菌落生長，符合規(guī)定?？捎糜跈z查試驗。

4.5 計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查

被檢計數(shù)培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基。試驗菌株：銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，接種量不大于100CFU。實驗操作如下：

（1）胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基：取10個無菌平皿，分別接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各2皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基，輕輕搖勻凝固后，于30～35℃培養(yǎng)，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌不超過3天，白色念珠菌、黑曲霉菌不超過5天，觀察計數(shù)；

（2）沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基：取4個無菌平皿，分別接種取白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各2皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基，輕輕搖勻凝固后，于20～25℃培養(yǎng)不超過5天，觀察計數(shù)；

（3）R2A瓊脂對照培養(yǎng)基：取6個無菌平皿，分別接種取銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各2皿，傾注R2A瓊脂對照培養(yǎng)基，輕輕搖勻凝固后，于30～35℃培養(yǎng)不超過3天，觀察計數(shù)；

（4）各培養(yǎng)基取1個無菌培養(yǎng)皿不接種菌作為空白對照；

（5）被檢培養(yǎng)基同法操作。

結(jié)果判斷：被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上菌落一致，則判斷該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。試驗結(jié)果見下表。

計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查試驗結(jié)果

從上表檢驗結(jié)果可見，5種試驗菌株的回收率均在50～200%范圍內(nèi)，并經(jīng)觀察鑒定菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，說明上述培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。

4.6 控制菌檢查培養(yǎng)基的適用性檢查

被檢培養(yǎng)基：麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基；試驗菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌控制菌培養(yǎng)基適用性檢查項目及所用菌株見下表。

4.6.1 麥康凱液體培養(yǎng)基適用性檢查

a、促生長能力檢查：取100ml麥康凱液體對照培養(yǎng)基3瓶，2瓶接種大腸埃希菌菌懸液，接種量不大于100cfu，搖勻，另一瓶不接種菌作為空白對照，于42～44℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h；被撿培養(yǎng)基同法操作。觀察培養(yǎng)基中試驗菌株的生長情況。培養(yǎng)基中的試驗菌應(yīng)生長良好，空白對照應(yīng)無菌生長。

檢驗結(jié)果：2瓶培養(yǎng)基內(nèi)均出現(xiàn)渾濁，且渾濁相當，證明試驗菌生長良好，空白對照為陰性，試驗結(jié)果符合規(guī)定。

b、抑制能力檢查：取100ml麥康凱液體對照培養(yǎng)基3瓶，2瓶接種金黃色葡萄球菌菌懸液，接種量大少于100cfu，搖勻，另一瓶不接種菌作為空白對照，于42～44℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h；被撿培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)基中試驗菌株的生長情況。培養(yǎng)基中的試驗菌應(yīng)不得生長，空白對照應(yīng)無菌生長。

檢驗結(jié)果：2瓶培養(yǎng)基均未出見渾濁，證明試驗菌未生長，空白對照為陰性，試驗結(jié)果符合規(guī)定。說明麥康凱液體培養(yǎng)基適用性檢查符合規(guī)定。

4.6.2 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查

促生長能力+指示特性檢查：將滅菌后的麥康凱瓊脂對照培養(yǎng)基，傾注平皿，30～35℃培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)后，備用，取3個無菌麥康凱瓊脂對照培養(yǎng)基平板，2個平板用涂布法接種大腸埃希菌菌懸液，接種量不大于100cfu，另一平板不接種菌作為空白對照，涂布均勻后。于30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h；被撿培養(yǎng)基同法操作。觀察培養(yǎng)基平板上試驗菌的生長情況。培養(yǎng)基平板上菌落應(yīng)生長良好，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特性、顏色、指示反應(yīng)應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，空白對照平板應(yīng)無菌落生長。

檢驗結(jié)果：被檢培養(yǎng)基平板上菌落與對照培養(yǎng)基平板上菌落均生長良好，且菌落大小、形態(tài)特征、顏色及指示反應(yīng)一致，空白對照平板無菌落生長，試驗結(jié)果符合規(guī)定。說明麥康凱瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查符合規(guī)定。

5 結(jié)論

5.1通過培養(yǎng)基適用性檢查試驗確定微生物實驗室所用培養(yǎng)基、制備程序、保存條件等是否滿足微生物限度檢查用要求，只有當培養(yǎng)基滿足培養(yǎng)基適用性的要求后，方可用于檢驗。根據(jù)適用性檢查試驗結(jié)果，上述培養(yǎng)基質(zhì)量均符合規(guī)定，可用于微生物檢查試驗。

5.2培養(yǎng)基的質(zhì)量控制試驗若不符合規(guī)定，應(yīng)尋找不合格的原因，以防此問題重復(fù)出現(xiàn)，任何不符合要求的培養(yǎng)基均不能使用。

【參考文獻】

[1] 國家藥典委員會，《中國藥典》2015年

[2] 中國藥品生物鑒定所，《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》（2010年版）北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010

[3] 中國藥典委員會，《中國藥典分析檢測技術(shù)指南》北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2017.6