消退素D1對(duì)急性胰腺炎小鼠NLRP3炎癥小體通路的影響

急性胰腺炎(AP)是臨床常見(jiàn)急腹癥，病情及預(yù)后與炎癥程度直接相關(guān)。AP炎癥程度與機(jī)體大量炎性遞質(zhì)合成釋放有關(guān)，抑制炎性遞質(zhì)的合成可減輕AP炎癥損傷。消退素D1作為ω-3多不飽和脂肪酸衍生的內(nèi)源性抗炎脂質(zhì)分子，可抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)合成，減輕AP小鼠胰腺和肺的炎癥反應(yīng)[1-2]，其機(jī)制可能通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體激活減少炎性遞質(zhì)合成[3]。NLRP3炎癥小體是機(jī)體炎癥時(shí)調(diào)節(jié)促炎因子合成的多蛋白復(fù)合體[4-5]，激活的NLRP3炎癥小體可引起IL-1β、HMGB1等促炎因子合成，參與AP炎癥損傷[6]。本研究采用雨蛙肽制備小鼠AP模型，觀察消退素D1對(duì)AP小鼠胰腺組織NLRP3炎癥小體通路的影響，探討消退素D1的抗炎作用機(jī)制。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：C57BL/6 雄性小鼠，6～8周齡，體重為18～22 g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，造模前12 h禁食，不禁水。將30只小鼠分成對(duì)照組、AP組、消退素D1組，每組10只。參照文獻(xiàn)[2]方法，以腹腔注射雨蛙肽50 μg/kg體重7次、每次間隔1 h建立小鼠AP模型。消退素D1組小鼠在造模前1 h及造模后4 h腹腔注射消退素D1 50μg/kg體重，對(duì)照組腹腔內(nèi)注射等容積生理鹽水。雨蛙肽購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，消退素D1購(gòu)自美國(guó)Cayman公司。造模結(jié)束后處死所有小鼠，處死前稱小鼠體重，處死后取血，分離血清保存，取胰腺、肺組織。

2．血清淀粉酶、脂肪酶測(cè)定：采用比色法檢測(cè)淀粉酶、脂肪酶，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按說(shuō)明書(shū)操作。

3．胰腺、肺濕重與體重比值：取新鮮小鼠胰腺及肺組織，稱濕重，計(jì)算胰腺、肺組織濕重與體重比值。

4．胰腺、肺組織病理學(xué)檢查：取胰腺、肺組織，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色。分別參照Schmidt等[7]和Imanaka等[8]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胰腺和肺組織進(jìn)行病理?yè)p傷評(píng)分。

5．胰腺NLRP3 mRNA表達(dá)檢測(cè)：取液氮凍存的胰腺組織，應(yīng)用Trizol提取總RNA，先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。引物序列：NLRP3上游引物5′-GCGGACTGTCCCATCAATGC-3′，下游引物5′-AGCAGCTCACCAACCACAGT-3′；β-actin上游引物5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT -3′，下游引物5′-TGCTAGGAGCCAGAGCAGTA-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，72℃ 20 s，循環(huán)40次。獲取目的基因和內(nèi)參的Ct值，以公式2-△△CT計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

6．NLRP3炎癥小體組分及效應(yīng)分子蛋白表達(dá)檢測(cè)：取胰腺組織，應(yīng)用裂解液提取蛋白質(zhì)，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、pro-IL-1β蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗鼠NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、pro-IL-1β抗體均購(gòu)于北京博奧森生物有限公司，工作濃度分別為1∶200、1∶200、1∶500、1∶300、1∶300，最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影、掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示相對(duì)表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．消退素D1對(duì)各組小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平的影響：對(duì)照組、AP組、消退素D1組小鼠血清淀粉酶水平分別為(336±93)、(731±75)、(533±39)U/L；脂肪酶水平為(232±65)、(1212±102)、(764±144)U/L。AP 組較對(duì)照組顯著升高，消退素D1組較AP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

2．消退素D1對(duì)各組小鼠胰腺、肺濕重與體重比的影響：對(duì)照組、AP組、消退素D1組胰腺濕重與體重比分別為(3.32±0.59)×10-3、(5.05±0.74)×10-3、(3.91±0.55)×10-3；肺濕重與體重比分別為(3.96±0.60)×10-3、(6.19±0.66)×10-3、(4.51±0.81)×10-3，AP組較對(duì)照組顯著升高，消退素D1組較AP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

3．消退素D1對(duì)各組小鼠胰腺和肺組織病理?yè)p傷的影響：對(duì)照組小鼠胰腺及肺組織結(jié)構(gòu)正常。AP組小鼠胰腺腺泡細(xì)胞腫脹，間質(zhì)充血、水腫，小葉間隙增寬，間質(zhì)和實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肺間質(zhì)明顯增寬，間質(zhì)及肺泡腔充血、出血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。消退素D1組小鼠胰腺組織腺泡細(xì)胞及間質(zhì)輕度水腫，間質(zhì)內(nèi)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肺間質(zhì)增寬、充血、水腫，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。對(duì)照組、AP組、消退素D1組胰腺病理評(píng)分分別為(0.6±0.2)、(5.3±0.4)、(3.1±0.4)分；肺組織病理評(píng)分分別為(1.6±0.5)、(9.6±0.5)、(5.6±0.6)分。AP 組較對(duì)照組顯著升高，消退素D1組較AP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

圖1 對(duì)照組、AP 組、消退素D1組胰腺(1A、1B、1C)及肺組織(1D、1E、1F)病理改變(HE ×400)

4．消退素D1對(duì)各組小鼠胰腺NLRP3 mRNA表達(dá)的影響：對(duì)照組、AP組、消退素D1組小鼠NLRP3 mRNA表達(dá)量分別為1.01±0.12、4.36±0.40、1.69±0.14，AP組顯著高于對(duì)照組，而消退素D1組又顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)。

5．消退素D1對(duì)AP小鼠NLRP3炎癥小體組分及效應(yīng)分子蛋白表達(dá)的影響:對(duì)照組、AP組、消退素D1組NLRP3蛋白表達(dá)量分別為0.62±0.11、1.50±0.08、0.93±0.07；ASC分別為0.15±0.04、1.81±0.07、0.92±0.05；caspase-1分別為0.37±0.05、1.11±0.04、0.70±0.06；效應(yīng)分子pro-IL-1β分別為0.32±0.07、1.54±0.07、0.72±0.02；IL-1β分別為0.34±0.06、1.60±0.03、0.80±0.07(圖2)。AP組顯著高于對(duì)照組，而消退素D1組又顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05或<0.001)。

圖2 對(duì)照組(1)、AP組(2)、消退素D1組(3)小鼠胰腺NLRP3炎癥小體組分(2A)及效應(yīng)蛋白表達(dá)(2B)

討論AP是臨床常見(jiàn)急腹癥，可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭。AP病情及預(yù)后與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性遞質(zhì)在胰腺炎性反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用，抑制炎性遞質(zhì)的合成可減輕AP胰腺病理?yè)p傷。研究表明[9-10]，AP炎癥遞質(zhì)的合成釋放受NLRP3炎癥小體的調(diào)控，抑制其激活可減輕AP的炎癥程度。作為炎癥因子的啟動(dòng)子，NLRP3炎癥小體可活化細(xì)胞因子前體，釋放炎癥遞質(zhì)和細(xì)胞因子，激發(fā)和調(diào)節(jié)AP炎癥反應(yīng)，與AP的發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系[11-12]。

NLRP3炎癥小體是由 NLRP3、ASC、pro-caspase-1組成的細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合體。Hoque等[6]通過(guò)分別敲除ASC、caspase-1、NLRP3基因，發(fā)現(xiàn)雨蛙肽誘導(dǎo)的AP嚴(yán)重程度減輕。Ren等[9]研究顯示,富氫鹽水抑制NLRP3炎癥小體激活可減輕AP炎癥反應(yīng)。Dong等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Sulforaphane通過(guò)抑制NLRP3、IL-1β等NLRP3炎癥小體通路組分的表達(dá)減輕雨蛙肽誘導(dǎo)的小鼠AP炎癥。研究表明[6，11]，AP時(shí)胰腺損傷釋放的DAMPs激活NLRP3，通過(guò)與ASC結(jié)合形成能夠募集pro-caspase-1平臺(tái)，通過(guò)剪切pro-caspase-1活化為caspase-1,促進(jìn)IL-1β、HMGB1等促炎因子的合成。IL-1β作為NLRP3炎癥小體發(fā)揮作用的主要效應(yīng)分子在AP早期即明顯升高，它是AP時(shí)無(wú)菌炎癥和損傷反應(yīng)的重要因子，還可引起胰腺腺泡細(xì)胞胰蛋白酶原激活并降低腺泡細(xì)胞活力[13]?；蚯贸齀L-1β或使用IL-1β拮抗劑可減輕AP的損傷[14]。因此，調(diào)控NLRP3炎癥小體通路可能是治療AP有效靶點(diǎn)。

消退素D1是ω-3多不飽和脂肪酸衍生的內(nèi)源性抗炎脂質(zhì)分子，具有限制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕炎性損傷的作用[1-2]。消退素D1通過(guò)抑制IL-1β、IL-6、IL-8等炎性遞質(zhì)合成[2]，減輕雨蛙肽誘導(dǎo)AP的胰腺和肺組織病理?yè)p傷，減輕AP炎癥反應(yīng)過(guò)程。Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)，消退素D1可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體活化，抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)合成，減輕同型半胱氨酸引起的腎小球損傷。Yin等[15]的研究顯示，消退素D1通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體激活發(fā)揮抗炎作用。

本研究通過(guò)雨蛙肽誘導(dǎo)制備AP小鼠模型，結(jié)果顯示消退素D1降低AP小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平及胰腺、肺濕重與體重比，減輕胰腺和肺組織病理?yè)p傷，減輕AP小鼠炎癥過(guò)程。消退素D1顯著下調(diào)胰腺組織NLRP3、ASC、caspase-1的表達(dá)，降低pro-IL-1β及IL-1β水平，提示消退素D1通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體通路，降低炎癥遞質(zhì)合成，減輕AP小鼠炎癥損傷，其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。