神經(jīng)節(jié)苷脂對過氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

隋廷林 彭兆新 馬麗娟 梁曉靜 范迎春

(山東東營勝利石油管理局勝利醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 東營 257055)

氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是腦缺血、腦缺血再灌注損傷等病理性腦損傷的病理基礎(chǔ)，因此減少氧自由基所導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡對腦血管病的治療具有重要意義〔1〕。神經(jīng)節(jié)苷脂是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上的一種含有唾液酸的鞘糖脂，在神經(jīng)元的生長、分化、凋亡等方面發(fā)揮重要作用〔2〕。以往研究報(bào)道神經(jīng)節(jié)苷脂對腦缺血再灌注大鼠海馬及腦缺血大鼠海馬組織具有顯著保護(hù)作用〔3，4〕，但具體的作用機(jī)制報(bào)道較少，本研究探討神經(jīng)節(jié)苷脂對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠PC12細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。主要試劑與儀器：噻唑藍(lán)(MTT)，Annexin V/PI流式雙染試劑盒，天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、9活性檢測試劑盒均購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒，小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗B淋巴細(xì)胞癌(Bcl)-2，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)，核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα及p-IκBα多克隆抗體均購自美國Abcam公司；垂直電泳儀，轉(zhuǎn)印電泳儀均購自美國伯樂公司；MK3酶標(biāo)儀購自美國thermo公司；168-1000XC型酶標(biāo)儀均購自美國BD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將處于生長對數(shù)期的PC12細(xì)胞隨機(jī)分為正常組，模型組，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組；其中模型組及神經(jīng)節(jié)苷脂組預(yù)先給予200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)24 h，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組給予12.5、25.0、50.0 μmol/L神經(jīng)節(jié)苷脂，正常組及模型組均給予等體積的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測細(xì)胞活力 將PC12細(xì)胞接種到96孔板，24 h后，按1.2分組及給藥后，每孔加入20 μl MTT孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μl二甲亞砜，使沉淀物溶解并于微量振蕩器震蕩10 min，最后于酶標(biāo)儀570 nm處測定OD值。

1.4Annexin V-PI流式雙染檢測細(xì)胞活力 將PC12細(xì)胞接種到6孔板，24 h后，按1.2分組、給藥并培養(yǎng)48 h，每組收集1×105個(gè)細(xì)胞/ml，并分別加入細(xì)胞結(jié)合緩沖液及PI染色液，在室溫孵育10 min后，1 h內(nèi)進(jìn)行流式檢測，分析細(xì)胞凋亡情況。

1.5細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)含量測定 將PC12細(xì)胞接種到6孔板，24 h后，按1.2分組、給藥并培養(yǎng)48 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加入20 μmol/L雙氫乙酰乙酸-二氨熒光黃(DCFH-DA)的PBS，37℃孵育2 h，后熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測。

1.6比色法檢測細(xì)胞中Caspase3、9活性 將PC12細(xì)胞接種到6孔板，24 h后，按1.2分組、給藥并培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并裂解，收獲上清液后按照Caspase3、9試劑盒說明書檢測其活性，酶標(biāo)儀測定OD 405 nm值，即Caspase3活性。

1.7Western印跡檢測細(xì)胞中Bax，Bcl-2，p-NF-κB p65及p-IκBα蛋白表達(dá) 將PC12細(xì)胞接種到6孔板，24 h，按1.2分組、給藥并培養(yǎng)48 h后，在冰浴條件下刮下細(xì)胞并裂解，獲得細(xì)胞上清液即是總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，蛋白變性。制作濃縮膠和分離膠，蛋白樣品上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，一抗溶液(兔抗Bax，Bcl-2，NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα及p-IκBα多隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋度皆為1∶100)孵育，4℃過夜；二抗室溫孵育1 h。最后于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)節(jié)苷脂對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活力、ROS強(qiáng)度及細(xì)胞凋亡的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低，ROS熒光強(qiáng)度明顯提高，早期及晚期細(xì)胞凋亡率顯著提高(均P<0.01)；與模型組比較，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組細(xì)胞活力顯著提高，熒光強(qiáng)度顯著降低，早期及晚期細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組PC12細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及ROS含量的比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01,下表同

2.2神經(jīng)節(jié)苷脂對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Caspase3、9活性的影響 與正常組比較，模型組Caspase3、9活性顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組PC12細(xì)胞中Caspase3、9活性的比較

2.3神經(jīng)節(jié)苷脂對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中Bax、Bcl-2及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組Bcl-2、Bax、p-NF-κB，p65及p-IκB2表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，神經(jīng)節(jié)苷脂低中、高濃度組Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組中Bax、p-NF-κB P65及p-IκB2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖1，圖2，表3。

圖1 各組PC12細(xì)胞中Bax及Bcl-2表達(dá)

圖2 各組PC12細(xì)胞中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

組別Bcl-2/GAPDHBax/GAPDHp-IκBα/IκBαp-NF-κB p65/NF-κB p65正常組0.95±0.110.16±0.010.12±0.010.08±0.01模型組0.18±0.021)1.28±0.121)1.98±0.201)0.94±0.091)低濃度組0.19±0.020.53±0.052)0.87±0.092)0.68±0.062)中濃度組0.45±0.042)0.55±0.052)0.43±0.042)0.20±0.022)高濃度組0.66±0.062)0.25±0.022)0.28±0.022)0.09±0.092)

3 討 論

腦缺血、腦缺血再灌注等病理過程可產(chǎn)生大量氧自由基，引起腦神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞膜過氧化，DNA斷裂，線粒體損傷，使病情加重并惡性循環(huán)〔1〕。H2O2是典型的氧自由基產(chǎn)物之一，PC12細(xì)胞與神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能類似，因此H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型常被用來研究神經(jīng)細(xì)胞凋亡的體外模型〔5〕。神經(jīng)節(jié)苷脂是位于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜表面上的一種含有唾液酸的糖鞘脂，是細(xì)胞膜的一部分，廣泛存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，能夠接收并對細(xì)胞膜內(nèi)外信息發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)〔2〕。研究顯示外源性神經(jīng)節(jié)苷脂能夠通過血腦屏障，對腦損傷區(qū)域的神經(jīng)組織進(jìn)行修復(fù)〔6〕。杜江等〔3〕研究表明神經(jīng)節(jié)苷脂能通過上調(diào)(CREB)表達(dá)進(jìn)而保護(hù)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷。高利潔等〔4〕表明神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著減少腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而改善腦損傷。同時(shí)體外研究顯示神經(jīng)節(jié)苷脂對6-羥基多巴胺、脂多糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有顯著抑制作用〔7〕。

本研究結(jié)果表明12.5、25.0、50.0 μmol/L神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著提高細(xì)胞活力，且此劑量范圍與以往研究報(bào)道較為一致〔7〕。另外，本研究結(jié)果表明神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著降低細(xì)胞凋亡率，與神經(jīng)節(jié)苷脂抑制6-羥基多巴胺、脂多糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡作用一致〔7〕。說明神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，且神經(jīng)節(jié)苷脂能降低H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中氧自由基水平。

細(xì)胞凋亡受細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，其中Bcl-2 家族最為常見。Bcl-2能夠與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號傳遞，促進(jìn)細(xì)胞存活。而Bax還能夠自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞給Caspase家族，使Caspase家族產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase家族接收到上游凋亡信號后，起始Caspase9將信號逐級傳遞并最終傳遞給Caspase3，使細(xì)胞膜破裂，DNA斷裂，最終引起細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的凋亡也受多種信號通路調(diào)控，NF-κB是其中一種。NF-κB是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物中的含有IκB增強(qiáng)位點(diǎn)的NF，在生理?xiàng)l件下，NF-κB亞基p65與IκB形成復(fù)合物靜置于細(xì)胞質(zhì)中，在受到紫外線，化學(xué)試劑等外界刺激后，復(fù)合物解離，IκB被降解并磷酸化，p65進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控Bcl-2、Caspase3等基因的轉(zhuǎn)錄〔8〕。研究表明H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Caspase3、9活性提高，Bax表達(dá)量上調(diào)，Bcl-2表達(dá)量下調(diào)，同時(shí)NF-κB信號通路被激活〔9～11〕，因此當(dāng)阻斷此過程能一定程度上抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著降低Caspase3、9活性，上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax、p-NF-κB p65及p-IκBα表達(dá)，最終抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

綜上，神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，與降低Caspase3、9活性，上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax表達(dá)有關(guān)，此過程是通過抑制NF-κB信號通路實(shí)現(xiàn)的。