Apelin-B對血管性癡呆大鼠學習記憶功能的影響

齊汝霞 張 鵬 楊欣欣 王鳳琴 程葆華

(濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，山東 濟寧 272067)

Aplein-13主要分布于心臟、大腦、下丘腦中〔1〕，研究表明其是正常人體血漿中最主要的Apelin亞型，血漿濃度為7.7～23.3 μg/L。并且其具有多種不同的生物功能和作用，參與心血管系統、呼吸系統、神經系統、消化系統和內分泌系統等生理病理過程調節(jié)〔2〕。血管性癡呆(VD)是僅次于阿爾茨海默病(AD)后的第二大癡呆性疾病，也是迄今為止唯一可以治療的癡呆類型〔3〕。本實驗觀察Apelin-13對VD大鼠學習記憶功能的影響并進一步探討其機制。

1 資料與方法

1.1儀器 電子天平(上海電子天平技術有限公司)；烤箱(型號YHG-30×35 ，深圳倍耐爾特科技有限公司)；跳臺儀(上海醫(yī)聯醫(yī)學儀器發(fā)展有限公司)；電子秤(上海先悅機電有限公司)。

1.2試劑 亞硝基鐵氰化鈉(天津光復精細化工研究所 注冊號：CNAB035-Q)；普魯卡因(上海羽朵生物 產品編號：ML5227)；Apelin-13(Sigma 貨品編號：A6469)；尼氏染色液(北京雷根生物技術有限公司 貨品編號：DK0022-3*100)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色液(美國索來寶公司 貨品編號：T8170)；磷酸二氫鈉(天津市大茂化學試劑廠 級別:分析純 CAS編號:13472-35-0)；多聚甲醛(天津博迪化工股份有限公司 級別:分析純 產品標準號:津Q/HG3076-99)；磷酸氫二鈉(天津市鼎盛鑫化工有限公司 CAS編號:10039-32-4 級別:分析純)；生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字號：H37022336)；水合氯醛(中國白鶴化工廠，批號：850208)。

1.3VD大鼠模型制備 選用清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重180～250 g，由濟寧醫(yī)學院動物飼養(yǎng)中心提供。大鼠在手術前24 h禁食，不禁水，10%水合氯醛3.5 ml/kg給大鼠腹腔內注射麻醉，麻醉后將其固定在大鼠手術臺上，頸部消毒后行正中切口，分離雙側頸總動脈，腹腔注射降壓藥亞硝基鐵氰化鈉1.25 mg/kg降低腦血流量 ，用動脈夾夾閉雙側頸總動脈15 min，再通10 min，共2次，完成后縫合傷口、保溫飼養(yǎng)。假手術組只分離頸總動脈不夾閉〔4〕。按Longa等〔5〕的五級評分法，符合以下5個條件之一均可鑒定模型成功：大鼠一側前肢不能充分伸展；向一側做環(huán)形運動；向一側傾倒；局部神經灶中度喪失；不能自然行走。

1.4動物分組及給藥 造模成功后將其隨機分為模型組、Apelin-13 50 μg/kg組、Apelin-13 100 μg/kg組，假手術組只分離頸總動脈不夾閉。給藥組側腦室注射Apelin-13 5 μl，模型組和假手術組分別注射等量蒸餾水。側腦室注射方法：將麻醉大鼠固定在側腦室定位儀上，剪開大鼠的頭皮，找到頭骨的前囟并以前囟為原點，右移1.6 mm，前移0.8 mm，用筆在此處標記，用大針頭鉆孔，把微量注射器針尖調至剛剛接觸頭骨處，然后針頭向下進2.8 mm，給予5 μl藥物，3 min內注射完，針頭在顱內停留1 min，然后縫合。

1.5TTC染色觀察對腦組織缺血的影響 將大鼠用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后直接取腦，在-18℃冰箱中冷凍20 min左右后，將鼠腦置入專用的腦槽，將大腦切為厚度2 mm的連續(xù)切片6片，依次放入十二孔板中，然后注入2%的TTC染色液，避光，放入37℃恒溫箱25 min，均勻染色后，用無菌注射器抽出染色液，再用4%多聚甲醛固定24 h，正常大腦組織染成鮮紅色，缺血組織呈蒼白色，將染色完成的大腦組織依據切片先后依次排列，用數碼相機拍照〔6〕。

1.6跳臺實驗觀察大鼠學習記憶能力 術后1 w進行跳臺實驗，跳臺實驗分為訓練期和實驗期。訓練時把大鼠放到跳臺內讓其熟悉環(huán)境3 min，然后接通電源5 min，大鼠感受到電擊后，其一般的反應是跳上平臺來逃脫電擊。訓練時如果有大鼠始終沒有跳上平臺則棄去不用。訓練結束后第2天，再一次將大鼠放入跳臺內進行實驗，首先讓大鼠適應3 min，再通電5 min，記錄大鼠第一次跳上平臺的時間，即跳臺潛伏期(SDL)，觀察大鼠在5 min內跳下平臺的次數，即錯誤次數(ET),若觀察期內大鼠未跳下平臺，ET計為0，SDL計為觀察時間為5 min〔5〕。

1.7利用尼氏染色觀察對大鼠神經元的影響 術后1 w，大鼠麻醉后，將其仰臥位固定于鼠板上，剪開胸腔，將針頭從心尖刺入左心室用4%多聚甲醛200～250 ml進行灌注(總灌注時間控制在30 min內)，至大鼠身體僵直，肝臟變硬，將頭部取下迅速取腦，持刀片將大鼠的大腦與小腦分開，留大腦部位平分為三份，取中間一份，置于裝有多聚甲醛液體中固定。24 h后將固定好的大腦切片拿出進行修整、水浸-脫水、透明-浸蠟與包埋-切片、裱片、烤片-脫蠟、復水-染色-脫水、透明-封固。將切片置于100倍顯微鏡下，觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神細胞尼氏小體染色情況〔7〕。

1.8統計方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析及SLD-t檢驗。

2 結 果

2.1TTC染色對腦組織缺血的影響 假手術組大鼠腦切片呈鮮紅色，模型組大鼠觀察到大面積蒼白色梗死灶。與模型組比較，Apelin-13 50 μg/kg組的缺血區(qū)縮小，Apelin-13 100 μg/kg組的缺血區(qū)基本消失。見圖1。

圖1 TTC染色后各組大鼠腦切片缺血區(qū)比較

2.2利用跳臺實驗觀察各組大鼠學習記憶能力

2.2.1對大鼠跳臺實驗SDL的影響 與假手術組〔(287.7±108.8)s〕比較，模型組大鼠跳臺實驗SDL〔(48.6±4.7)s〕顯著縮短(P<0.01)。與模型組相比，Apelin-13 50 μg/kg組〔(184.0±125.67)s〕和Apelin-13 100 μg/kg組〔(192.7±146.1)s〕的SDL顯著延長(P<0.05，P<0.01)。

2.2.2對跳臺實驗ET的影響 與假手術組〔(0.4±1.1)次〕比較，模型組大鼠跳臺實驗的ET〔(3.6±2.4)次〕顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，Apelin-13 100 μg/kg組〔(0.8±0.7)次〕大鼠跳臺實驗ET明顯減少(P<0.05)。Apelin-13 50μg/kg組大鼠跳臺實驗ET〔(2.2±1.8)次〕無明顯變化(P>0.05)

2.3利用尼氏染色觀察對大鼠神經元的影響 假手術組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經細胞形態(tài)結構完整，細胞核多為圓形或橢圓形且呈淡紫色，核仁清晰可見，細胞質中的尼氏顆粒豐富。模型組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經細胞數量明顯減少，細胞多呈空泡狀，神經元核仁固縮或消失，尼氏顆粒不明顯。

與模型組相比，Apelin-13 50 μg/kg組CA1、CA3區(qū) 神經細胞數量增多，形態(tài)趨于完整，核仁分明;Apelin-13 100 μg/kg組神經元數明顯增多，細胞排列緊密，形態(tài)正常，尼氏體多且清晰。見圖2、圖3。

圖2 各組VD大鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)比較(×40)

圖3 各組VD大鼠海馬CA3區(qū)神經元形態(tài)比較(×40)

3 討 論

本實驗采用夾閉雙側頸總動脈缺血再灌注并配以注射亞硝基鐵氰化鈉的方法，制備VD模型，造成大鼠進行性的學習記憶損傷和認知功能障礙，能夠較好的模擬人的VD狀態(tài),用于藥理學研究。TTC和大鼠腦組織里的琥珀酸脫氫酶產生反應，生成紅色的不溶物質，然而在缺血的大腦組織中脫氫酶的反應性降低，不能發(fā)生染色反應的而表現為白色，所以可以區(qū)分正常的腦組織和缺血的腦組織〔8,9〕。海馬可被分為CA1、CA2、CA3、CA4四個區(qū)〔10〕。目前研究表明，這4個區(qū)域都和學習記憶尤其空間認知功能有關。尼氏體是神經細胞中的嗜堿性的細粒或者小體，是一種含鐵質的核酸蛋白，在正常情況下都有其固定的形態(tài)，標志著神經細胞的存在，可以被堿性染料如焦油紫染成紫藍色。當其受到損傷時，尼氏體變得模糊不清甚至消失，所以尼氏體能表現神經元的功能狀態(tài)。本實驗表明Apelin-13在一定程度上可以減少神經細胞的損傷，對神經元具有保護和修復作用。根據跳臺實驗推測 Apelin-13能提高VD大鼠的學習記憶能力。綜上，Apelin-13側腦室注射后，VD大鼠學習記憶功能得以改善，其機制可能與緩解腦組織缺血、減少海馬區(qū)神經細胞損傷有關，其具體機制有待進一步研究。