乙肝病毒X結合蛋白在肝細胞癌中表達及臨床意義

司 超 劉 俊 李霞斌 姚輝華

(西南醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，四川 瀘州 646000)

肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第二位。肝癌具有起病隱匿、進展迅速、惡性程度高和術后復發(fā)轉移等特點，因此肝癌患者的病死率也是居高不下，占癌癥相關死因的第三位〔1〕。早期診斷和治療能夠明顯提高肝癌患者的臨床治愈率、降低術后復發(fā)率和延長生存時間。研究表明很多分子標志物在腫瘤的早期診斷及預后評估中具有重要的價值。乙肝病毒X結合蛋白(HBXIP)是一種多功能的細胞組成型蛋白，能夠與乙肝病毒DNA編碼的X蛋白(HBX)的羧基末端結合，改變乙肝病毒的復制周期〔2〕。研究表明，HBXIP的表達在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和胃癌等多種惡性腫瘤中顯著升高，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后相關〔3，4〕。目前關于HBXIP與肝癌之間相關性的研究尚少見報道，本研究旨在探討HBXIP蛋白在肝癌中表達及其與腫瘤臨床病理特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料 2014年12月至2017年4月西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院行手術切除的肝癌存檔石蠟標本54例，另選取手術切緣無腫瘤細胞浸入的肝組織標本29例作為癌旁對照與正常肝組織15例(肝囊腫14例、肝血管瘤1例)。肝癌患者年齡36～73歲，平均(48.6±9.32)歲。肝癌患者術前均未行放化療等輔助治療，術后病理證實為肝細胞癌。

1.2試劑和方法 HBXIP兔抗人單克隆抗體購自美國CST公司，乙二胺四乙酸(EDTA)修復液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自福州邁新生物技術公司。采用免疫組化EnVision法檢測HBXIP的表達，具體操作主要參照試劑盒說明書進行：對包埋石蠟塊進行連續(xù)切片，脫蠟水化，3%雙氧水消除過氧化物酶活性，EDTA修復液高溫高壓修復抗原，滴加一抗后27℃孵育60 min，滴加二抗后27℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用預實驗中陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3免疫組化判定標準 以細胞質中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒判定為HBXIP表達陽性。由兩位病理醫(yī)師進行雙盲閱片，每張切片高倍視野(×400倍)下隨機選取5個視野，根據染色強度和陽性細胞數的比例進行綜合評估。染色強度：細胞無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞數：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。然后將染色強度與陽性細胞數的評分相加，總的評分<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.4統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1HBXIP在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達 HBXIP的陽性表達定位于細胞質，呈彌漫性棕黃色顆粒；HBXIP在肝癌組織中的陽性表達率〔73.6%(39/54)〕明顯高于癌旁組織〔48.3%(14/29)〕和正常肝組織〔33.3%(5/15)〕(P<0.05)；而在癌旁組織與正常肝組織中表達差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2HBXIP表達與肝癌臨床病例特征的關系 肝癌組織中HBXIP表達與組織分化、癌栓形成、TNM分期相關(P<0.05)，而與肝癌患者的性別、年齡、腫瘤數目、腫瘤直徑、乙肝表面抗原(HBsAg)、血清甲胎蛋白(AFP)水平、肝硬化、腫瘤轉移、肝功能分級、包膜是否完整等無關(P>0.05)，見表1。

表1 HBXIP陽性表達與肝癌臨床病理特征的關系〔n(%)〕

3 討 論

肝癌的形成是一個多因素、多基因共同參與的生物學過程，而癌基因激活和抑癌基因缺失在這個過程中發(fā)揮重要的作用。HBXIP最早是由Melegari等〔2〕從肝癌HepG2細胞中篩選得到的細胞組成型蛋白，全長由173個氨基酸組成，分子量為18 kD，其編碼基因位于人染色體1號染色體短臂(1p13.2)上。HBXIP是一種多功能的調節(jié)蛋白，能夠與HBX蛋白和survivin蛋白相結合形成復合物，抑制caspase9的激活，從而抑制線粒體介導的細胞凋亡途徑〔5〕。HBXIP可以通過激活PI3/蛋白激酶B(Akt)信號通路〔6〕，調控小鼠雙微體基因(MDM)2/p53負反饋環(huán)〔7〕，調節(jié)腫瘤細胞的糖代謝〔8〕和脂代謝〔9〕等途徑來促進細胞增殖。HBXIP可以激活Akt/內皮型一氧化氮合酶信號通路或上調成纖維生長因子(FGF)8、血管內皮生長因子(VEGF)的表達，促進腫瘤血管形成〔10，11〕。HBXIP還能通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MEKK)2/細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2/鈣蛋白酶小亞基(Capn)4信號通路和調節(jié)組蛋白乙?；D移酶(GCN)5介導的α-微管蛋白乙?；?，促進腫瘤細胞浸潤和轉移〔12，13〕。HBXIP在多種惡性腫瘤中高表達，如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等，并與腫瘤的生長、浸潤轉移和預后相關。馮姝婷等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)HBXIP在肝癌BEL7402、7721、HepG2、HepG3細胞中的表達較高。

本研究結果與樸俊杰等〔3〕關于HBXIP在胃癌中的研究基本一致，但李曉剛等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)HBXIP在膀胱癌的細胞質和細胞核中均有表達，這種表達差異可能是HBXIP在不同腫瘤中的致癌機制存在差異或HBXIP抗體的生產廠家不同引起的。本文結果與李巍巍等〔15〕對HBXIP在子宮內膜癌中的研究相似，表明HBXIP在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程起重要的作用。本研究提示HBXIP的高表達可能促進了肝癌的惡性分化、浸潤轉移和臨床進展。已有研究顯示，肝癌的組織分化和癌栓形成是影響腫瘤預后的重要因素〔16〕，因此，推測HBXIP可能在肝癌的預后評估中有一定的參考價值，但是關于HBXIP在肝癌發(fā)生和發(fā)展過程中的具體作用機制仍不清楚，有待今后在分子水平上的深入研究。

綜上，HBXIP在肝癌中表達上調，是肝癌發(fā)生發(fā)展過程中重要的調節(jié)因子。HBXIP表達與肝癌的浸潤轉移、惡性分化和臨床進展相關，可能成為肝癌診斷和預后評估的分子標志物。