ASXL1突變的髓系腫瘤患者共突變基因譜及其臨床意義

滕廣帥，王穎韶，徐晶，杜晨霄，王艷，陳亞芳，盛夢(mèng)瑤，白姣姣，張磊，周圓，楊逢春，白潔△

隨著二代基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)基因異常與髓系腫瘤患者的關(guān)系受到了臨床學(xué)者的重視［1］。近年來(lái)，多個(gè)學(xué)者的研究結(jié)果表明，髓系腫瘤的發(fā)生除了與特定的起始突變相關(guān)外，伴隨基因突變與疾病的發(fā)生發(fā)展也有密切關(guān)系。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)伴有ASXL1突變的髓系腫瘤預(yù)后不良［2-3］。但是其共突變的基因譜及其臨床特征報(bào)道較少。本研究采用包含112個(gè)血液腫瘤相關(guān)基因的靶向測(cè)序技術(shù)對(duì)1 353例髓系腫瘤患者進(jìn)行基因突變檢測(cè)，篩選出138例ASXL1突變患者，對(duì)其共突變基因譜及臨床特征進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2015年1月1日—2018年5月30日在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院確診并保留骨髓細(xì)胞DNA標(biāo)本的髓系腫瘤患者1 353例，共篩選出138例AXSL1突變患者，其中男75例，女63例，平均年齡（45.8±16.7）歲。采用WHO（2016）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷和分型［4-6］。其中包括急性髓系白血?。ˋML）47例（34.06%），骨髓增生異常綜合征（MDS）52例（37.68%），骨髓增殖性腫瘤（MPN）29例（21.01%），MPN/MDS 10例（7.25%）。

1.2 方法

1.2.1 靶向測(cè)序檢測(cè)基因突變 取患者的骨髓或外周血，分離出單個(gè)核細(xì)胞，提取DNA，取l μg DNA制備全基因組DNA文庫(kù)。使用PCR引物擴(kuò)增目的基因組（112個(gè)血液腫瘤相關(guān)基因），將目標(biāo)區(qū)域DNA富集后，采用Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后原始數(shù)據(jù)利用共識(shí)編碼序列（CCDS）、人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（HGl9）、dbSNP（v138）、1000 genomes、COSMIC、PolyPhen和SIFT等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定致病性基因突變位點(diǎn)。平均基因覆蓋率98.1%，平均測(cè)序深度1314x，95%的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序深度超過(guò)20x。

1.2.2 染色體核型分析 收集患者骨髓細(xì)胞，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h，秋水仙堿處理1 h，收集細(xì)胞常規(guī)制片，G或R顯帶，根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN2013）》描述核型異常［7］。依據(jù)修訂的國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)（IPSS-R）染色體核型分組標(biāo)準(zhǔn)［8］進(jìn)行染色體核型預(yù)后分組。

1.2.3 隨訪 所有病例隨訪至2018年5月30日，隨訪資料來(lái)源于門診病歷和住院病歷。對(duì)死亡病例，依病歷記錄或與患者家屬電話聯(lián)系確認(rèn)?？偵妫∣S）期按確診至死亡的時(shí)間或確診至2018年5月30日計(jì)算，失訪患者共13例（9%），中位隨訪時(shí)間為21（1～75）個(gè)月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料如符合正態(tài)分布，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布時(shí)采用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，2組間的分類變量比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析。雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ASXL1突變的患者突變基因的共存情況 138例ASXL1突變的髓系腫瘤患者中，共突變基因共有89個(gè)，96.4%（133例）的患者伴有至少1個(gè)共突變基因。最常見(jiàn)的共突變基因?yàn)镽AS途徑基因（35例，25.4%），其他依次為SETBP1基因（30例，21.7%）、FAT1基因（26例，18.8%）、CREBBP基因（22例，15.9%）及TET2基因（21例，15.2%）。ASXL1突變髓系腫瘤患者突變基因的共存關(guān)系見(jiàn)圖1。

Fig.1 Gene mutation correlation in 138 patients with ASXL1 mutation圖1 138例ASXL1突變的患者突變基因的共存情況

2.2 共突變基因的功能分類 共突變基因中涉及多種通路，其中表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因突變率為55.8%（77/138），剪切子相關(guān)基因?yàn)?8.2%（39/138），信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因?yàn)?5.9%（91/138），轉(zhuǎn)錄因子為36.9%（51/138），細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因?yàn)?8.8%（26/138），見(jiàn)表1。

2.3ASXL1與RAS、SETBP1、FAT1、TET2、CREBBP基因共突變患者臨床特征分析 （1）與ASXL1+RAS-患者相比，ASXL1+RAS+患者血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)下降，染色體核型異常比例升高，病死率升高；2組患者在年齡、性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）ASXL1+SETBP1+與ASXL1+SETBP1-患者、ASXL1+FAT1+與ASXL1+FAT1-患者在性別、年齡、染色體核型、病死率以及血細(xì)胞計(jì)數(shù)等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.4ASXL1與RAS、SETBP1、FAT1等基因共突變患者的預(yù)后分析ASXL1+RAS+患者預(yù)后明顯差于ASXL1+RAS-患者；而ASXL1+SETBP1+與ASXL1+SETBP1-患者、ASXL1+CREBBP+與ASXL1+CREBBP-患者、ASXL1+TET2+與ASXL1+TET2-患者、ASXL1+FAT1+與ASXL1+FAT1-患者的預(yù)后情況無(wú)差異，見(jiàn)圖2、表3。

Tab.1 Mutated genes and their incidence in the spectrum表1 共突變基因譜中涉及的突變基因及發(fā)生率

3 討論

髓系腫瘤是血液腫瘤中比較重要的一類疾病，包括MPN、MDS、MDS/MPN和AML等。基因測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用使髓系腫瘤的診治更加精準(zhǔn)，目前二代基因測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為髓系腫瘤患者診治和預(yù)后評(píng)價(jià)的重要檢測(cè)項(xiàng)目，臨床研究發(fā)現(xiàn)髓系腫瘤患者可以出現(xiàn)多種基因突變，包括RAS途徑基因（NRAS、KRAS、NF1、PTPN11、CBL）突變，RNA 剪切子基因（U1AF1、SRSF2、SF3B1、U2AF2、ZRSR2）突變，轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因（CEBPA、RUNX1、GATA3、TAL1）突變，TP53和ASXL1突變等。人類ASXL1基因定位于染色體20q11，編碼長(zhǎng)度為1 541個(gè)氨基酸的核蛋白，在血液細(xì)胞等多種組織中廣泛表達(dá)［9-10］，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)ASXL1突變與多種髓系腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)［2-3］。Bejar等［11］對(duì)439例MDS患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ASXL1與MDS不良預(yù)后顯著相關(guān)。Pratcorona等［12］發(fā)現(xiàn)ASXL1突變是AML的一個(gè)不良預(yù)后因素。但ASXL1單基因單層面分析不足以指導(dǎo)臨床預(yù)后，ASXL1往往伴發(fā)多種基因突變，共突變基因分析可以更精準(zhǔn)地評(píng)估預(yù)后。本研究對(duì)138例ASXL1突變的髓系腫瘤患者的共突變基因譜進(jìn)行分析顯示，共突變基因共有89個(gè)，按功能區(qū)分包括以下幾類：表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因（55.8%），剪切子相關(guān)基因（28.2%），信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因（65.9%），轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因（36.9%），細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因（18.8%）及其他，其中最常見(jiàn)基因?yàn)镽AS途徑基因、SETBP1、FAT1、CREBBP和TET2等，這與國(guó)內(nèi)外髓系腫瘤基因譜的分析結(jié)果基本一致［13-14］。

Fig.2 Overall survival curves of patients with ASXL1 and co-mutated genes圖2 ASXL1基因共突變的患者總生存曲線

Tab.2 Clinical characteristics of patients with ASXL1 and RAS,SETBP1,FAT1,TET2 and CREBBP gene mutation表2 ASXL1與RAS、SETBP1和FAT1等基因共突變患者臨床特征

本研究對(duì)ASXL1所有伴隨突變基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ASXL1突變的髓系腫瘤患者基因譜中最常見(jiàn)突變基因?yàn)镽AS途徑基因、SETBP1、FAT1、CREBBP和TET2。通過(guò)分析這些患者的臨床特征發(fā)現(xiàn)，SETBP1、FAT1、CREBBP和TET2等基因突變患者與未突變患者在染色體、生存時(shí)間和血細(xì)胞數(shù)等方面無(wú)顯著差異。而ASXL1+RAS+患者血紅蛋白及血小板數(shù)量明顯低于ASXL1+RAS-患者，同時(shí)生存時(shí)間也明顯縮短，提示ASXL1與RAS基因共突變患者較ASXL1+RAS-患者預(yù)后更差。RAS通路包括NRAS、KRAS、NF1、PTPN11和CBL等基因，是一個(gè)多基因家族，可以編碼鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，RAS基因突變導(dǎo)致RAS蛋白發(fā)生變化，使得RAS蛋白只能與細(xì)胞內(nèi)的三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）分子結(jié)合而不能裂解和釋放GTP分子，從而引起細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致多種腫瘤的形成與進(jìn)展［15］。由此可見(jiàn)，RAS基因組突變與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。而其他與表觀遺傳、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、剪切子相關(guān)和細(xì)胞凋亡等相關(guān)基因共突變與預(yù)后無(wú)明顯關(guān)系。Chen等［16］、Chou 等［17］、Vannucchi等［18］分別通過(guò)大樣本研究發(fā)現(xiàn)，ASXL1突變與MDS、AML、PMF等疾病不良預(yù)后密切相關(guān)，而ASXL1突變常伴有多種共突變。本研究發(fā)現(xiàn)ASXL1與RAS基因組共突變與髓系腫瘤不良預(yù)后相關(guān)，這在國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道。髓系腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，有多種因素作用參與，共突變基因分析應(yīng)用于臨床能夠更精準(zhǔn)進(jìn)行疾病預(yù)后分層，進(jìn)而指導(dǎo)藥物選擇，因此，擴(kuò)大樣本數(shù)量并進(jìn)行每一種髓系腫瘤的預(yù)后模型分析是筆者下一步的工作重點(diǎn)。

Tab.3 Comparison of cumulative survival rate of patients with ASXL1 and RAS,SETBP1 and FAT1 gene mutation表3 ASXL1與RAS、SETBP1和FAT1等基因共突變患者累積生存率比較