原花青素對環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影響

孔妮，劉超，楊方浩，張騰元，王寶堃，高慧婕△

原花青素又名前花青素（proantho cyanidins，PC），是一種在熱酸處理下能產(chǎn)生花色素的多酚化合物，大量存在于葡萄籽以及藍莓葉中，是目前國際上公認的清除人體內(nèi)自由基有效的天然抗氧化劑［1］。原花青素能夠清除各種自由基、加快膽固醇分解、調(diào)節(jié)血脂、改善微循環(huán)、抗腫瘤、抗衰老，并且具有成本低、毒性低、用藥安全等優(yōu)點，因此被大量應用于化妝品以及保健品中［2-6］。但是，目前國內(nèi)外研究的熱點主要集中在其抗氧化功效上，對原花青素的免疫功能調(diào)節(jié)的相關研究尚少［7-8］。因此，研究原花青素對機體免疫功能的影響，從而指導原花青素對免疫抑制整體療效的評估和合理使用都是十分必要的。本研究利用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）建立小鼠免疫抑制模型，探究原花青素對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用及其對白細胞介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的影響，為原花青素在預防、治療、提高機體免疫力及臨床應用等多方面提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級ICR小鼠40只，4～8周齡，體質(zhì)量25～30 g，雌雄各半，自由進食，由濟寧醫(yī)學院實驗動物中心提供；普通級豚鼠5只，體質(zhì)量300～400 g，自然喂養(yǎng)，由濟寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑與儀器 原花青素（貨號L1517228）和環(huán)磷酰胺（貨號C106991-1g/E1606077）購自Aladdin試劑公司；2，4-二硝基氟苯（DNFB）購自上海寶曼生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；SYBR GreenⅠPCR kit及PCR引物購自上海生工生物工程公司；綿羊紅細胞（SRBC）購自北京索萊寶科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自武漢基因美生物科技公司。CFX96實時熒光PCR儀（美國Bio-Rad公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥 40只ICR小鼠按隨機數(shù)字表法均分為4組：正常對照組、Cy模型組、PC高劑量組（100 mg/kg）、PC低劑量組（80 mg/kg）。實驗共7 d，PC組每只小鼠分別給予高、低劑量的PC 0.4 mL/d灌胃，其余2組灌胃等體積的生理鹽水。免疫抑制模型制備：Cy模型組及PC高、低劑量組均在第2天和第4天腹腔注射Cy（50 mg/kg）0.1 mL，正常對照組注射等量生理鹽水。

1.2.2 胸腺和脾臟指數(shù)測定 實驗第7天灌胃后2 h，標記，稱質(zhì)量，處死小鼠，取小鼠的胸腺及脾臟進行稱量。計算胸脾指數(shù)：胸腺（脾臟）指數(shù)=胸腺（脾臟）質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.2.3 外周血清溶血素測定 實驗第6天，小鼠腹腔注射10%的綿羊紅細胞0.2 mL。最后1 d灌胃2 h后，每只小鼠眼框取血0.3 mL，室溫放置10 min，2 000 r/min離心30 min，取上清，以PBS為溶劑將血清進行1∶100稀釋，取稀釋后的血清0.1 mL置于酶標板中，然后加入等量0.2%的SRBC和豚鼠血清（1∶20），每鼠均做2個復孔，且分別設置血清對照、綿羊紅細胞對照、豚鼠血清對照以及PBS空白對照各兩個復孔，快速放置于37℃的恒溫水浴箱中溫浴60 min，2 000 r/min離心20 min。最后取上清150 μL，放置于一個新的酶標板中，用酶標儀測定450 nm下光密度（OD）值。

1.2.4 DNFB致遲發(fā)性超敏反應（DTH）檢測 實驗第2天，用生理鹽水涂濕每只小鼠的腹部，后用剪刀貼皮剪去小鼠腹部的毛。面積大約為1 cm×1 cm，待腹部變干后，去毛部位涂抹50 μL 1%的DNFB，次日再涂抹一次；最后一次灌胃后，在小鼠的右耳部涂抹10 μL 0.2%的DNFB，24 h后，將小鼠處死，分別用打孔器取相同部位左右耳片，用精密電子天平稱取小鼠左右耳的質(zhì)量，并計算質(zhì)量差，計算鼠耳腫脹度，用以檢測遲發(fā)性超敏反應。

1.2.5 ELISA法測定外周血的TNF-α、IL-10的表達 每只小鼠眼框取血0.3 mL，25℃靜置15 min，2 000 r/min離心30 min，取上清液。參照ELISA試劑盒說明，在450 nm波長下測定各個樣品和標準品的OD值。

1.2.6 RT-qPCR測定脾細胞TNF-α和IL-10 mRNA的表達 取小鼠脾臟（＜0.1 g），Trizol法提取脾細胞RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。使用SYBR Green在PCR擴增儀上行qPCR。PCR 引物序列如下：IL-10（118 bp）上游 5′-TGGGTTGCCAAGCCTTATCG-3′，下 游 5′-TTCAGCTTCT?CACCCAGGGA-3′；TNF-α（209 bp）上游5′-ACCGTCAGCC?GATTTGCTAT-3′，下 游 5′-CCGGACTCCGCAAAGTCTAA-3′。采用 GAPDH（183 bp）作為內(nèi)參，上游 5′-ATTCAACG?GCACAGTCAAGG-3′，下游 5′-GCAGAAGGGGCCGGAGAT?GA-3′。采用2-ΔΔCt進行目的基因相對表達量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原花青素對小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響 與正常對照組相比，Cy模型組胸腺和脾臟指數(shù)均明顯縮?。≒＜0.05）。與Cy模型組相比，PC低劑量組的脾臟指數(shù)顯著增大（P＜0.05），并且PC高劑量組胸腺和脾臟指數(shù)均較低劑量組增大（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Effects of PC on spleen index,thymus index,serum hemolysin and DTH in mice表1 PC對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)和血清溶血素、小鼠遲發(fā)性超敏反應的影響 （n=10,±s）

Tab.1 Effects of PC on spleen index,thymus index,serum hemolysin and DTH in mice表1 PC對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)和血清溶血素、小鼠遲發(fā)性超敏反應的影響 （n=10,±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與Cy模型組比較，c與PC低劑量組比較，P＜0.05；表2同

組別正常對照組Cy模型組PC低劑量組PC高劑量組F胸腺指數(shù)（mg/g）2.33±0.53 1.37±0.25a 1.71±0.36ab 2.26±0.64bc 9.405＊＊脾臟指數(shù)（mg/g）3.29±0.50 1.73±0.28a 2.62±0.39ab 3.16±0.45bc 29.369＊＊血清溶血素（OD值）0.53±0.09 0.37±0.08a 0.44±0.07ab 0.49±0.06b 8.584＊＊耳廓腫脹度（mg）0.29±0.05 0.17±0.05a 0.22±0.04ab 0.27±0.07bc 10.870＊＊

2.2 原花青素對小鼠血清血溶素的影響 Cy模型組小鼠血清溶血素的生成量較正常對照組顯著降低（P＜0.05），PC高、低劑量組小鼠血清血溶素生成水平較Cy模型組升高（P＜0.05），見表1。

2.3 原花青素對小鼠DNFB致遲發(fā)性超敏反應的影響 Cy模型組小鼠耳廓腫脹度低于正常對照組（P＜0.05），而PC高、低劑量組小鼠的耳廓腫脹度均高于Cy模型組（P＜0.05），見表1。

2.4 原花青素對小鼠血清IL-10和TNF-α表達的影響 與正常對照組相比，Cy模型組小鼠血清IL-10的表達水平升高（P＜0.05），與Cy模型組相比，PC高劑量組的IL-10的表達水平明顯降低（P＜0.05），而PC低劑量組變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與正常對照組相比，Cy模型組小鼠血清TNF-α的表達水平顯著降低（P＜0.05），與Cy模型組相比，PC高、低劑量組TNF-α的表達均有所升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Effects of PC on IL-10 and TNF-α in mice表2 PC對小鼠IL-10和TNF-α的影響 （n=10，±s）

Tab.2 Effects of PC on IL-10 and TNF-α in mice表2 PC對小鼠IL-10和TNF-α的影響 （n=10，±s）

組別正常對照組Cy模型組PC低劑量組PC高劑量組F外周血（ng/L）IL-10 19.25±5.06 28.57±3.54a 25.10±4.66a 22.37±6.38b 6.267＊＊TNF-α 44.81±5.62 28.55±3.56a 36.85±7.55ab 39.19±6.05ab 13.236＊＊脾細胞IL-10 mRNA 1.01±0.09 2.14±0.24a 1.35±0.06b 1.18±0.07abc 133.36＊＊TNF-α mRNA 1.01±0.14 0.45±0.05a 0.89±0.08ab 0.95±0.05ab 90.84＊＊

2.5 原花青素對小鼠脾細胞IL-10和TNF-α mRNA表達的影響 Cy模型組小鼠IL-10 mRNA表達水平顯著高于正常組，TNF-α mRNA的表達顯著降低（P＜0.05）；與Cy模型組相比，PC高、低劑量組均能夠有效下調(diào)IL-10 mRNA的表達，上調(diào)TNF-α mRNA的表達（P＜0.05），見表2。

3 討論

作為重要的免疫器官，小鼠的胸腺和脾臟可以反映出機體的免疫水平，因此可以用胸腺和脾臟指數(shù)評價小鼠的整體免疫狀態(tài)，包括機體的體液免疫及細胞免疫功能［9］。本研究顯示，PC可以恢復由Cy所致的胸腺和脾臟指數(shù)的減少，顯示出其對中樞及外周免疫器官均有良好的保護活性和很好的免疫增強效果。此外，溶血素實驗顯示PC可提高小鼠外周血的抗體生成率，增強體液免疫；遲發(fā)性超敏反應顯示PC可提高機體的遲發(fā)性超敏反應，即提高了遲發(fā)性超敏反應細胞TDTH（Th1）的活性，增強細胞免疫，這與PC對小鼠整體免疫水平的提高一致。

Th1細胞是TNF-α重要的產(chǎn)生細胞，參與體內(nèi)多種免疫調(diào)節(jié)作用，可促進巨噬細胞、淋巴細胞活化，也可以促進內(nèi)皮細胞黏附分子的表達和PAF、花生四烯酸（AA）的釋放，對中性粒細胞有很好的活化和趨化作用［10］。無論是外周血TNF-α的表達，還是小鼠脾臟TNF-α mRNA的表達，均顯示PC的應用提高了TNF-α的產(chǎn)生，這與遲發(fā)性超敏反應中Th1的活性增加是一致的，提示PC可以通過提高Th1的活性，促使其產(chǎn)生大量的TNF-α，提升機體細胞免疫功能。

負性調(diào)節(jié)因子在免疫應答的維持中也發(fā)揮重要作用。IL-10是免疫應答中重要的負性調(diào)節(jié)分子之一，目前認為其高表達與免疫細胞的抑制高度有關［11］。IL-10可以抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生促炎性活性分子，抑制T細胞參與的細胞免疫應答。有研究顯示缺乏IL-10的小鼠，給予其受體封閉抗體后，T細胞的功能可一定程度恢復［12］。Cheshier等［13］研究發(fā)現(xiàn)pycnogenol（含有原花青素分子）可以部分恢復喂食乙醇后小鼠的免疫功能不全的癥狀，降低喂食乙醇小鼠的脾細胞IL-10分泌量，同時提高自然殺傷（NK）細胞的殺傷活性。本研究發(fā)現(xiàn)，在灌服PC后，小鼠外周血及脾臟IL-10的表達水平均較Cy組有所下降，提示PC可能通過下調(diào)IL-10的表達而促進免疫應答。這可能是PC免疫調(diào)節(jié)作用的另一機制，但PC如何下調(diào)IL-10的表達仍有待進一步深入研究。

綜上所述，PC對小鼠的整體免疫機能有一定的保護作用，并且有可能是通過對IL-6和IL-10的調(diào)節(jié)來參與對免疫功能的調(diào)節(jié)，為利用PC進一步開發(fā)提高抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力的食品、藥品和保健品提供了有力依據(jù)。