丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病模型大鼠腎組織中Nrf-2和HO-1的影響

明建松 ，王曉雪 ，袁玉華△

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）為糖尿病并發(fā)癥的一種，其也是引發(fā)終末期腎臟病（ESRD）的病因之一，且本病的發(fā)病率逐年上升，大約有40%的DN患者最終會(huì)發(fā)展成ESRD［1-2］。目前，DN的發(fā)病機(jī)制尚未明了，既往的研究認(rèn)為其可能與腎血流動(dòng)力學(xué)改變、遺傳、炎癥、糖脂代謝紊亂以及氧化應(yīng)激等機(jī)制有關(guān)［3-4］。目前，對(duì)于DN，除控制血壓、血糖等對(duì)癥支持治療外，尚無治療本病的特效藥物，很多患者在進(jìn)入ESRD后，只能通過腎移植或終身透析來延續(xù)生命，大大增加了患者家庭與社會(huì)的負(fù)擔(dān)，同時(shí)患者還需承擔(dān)巨大的精神壓力。因此，對(duì)于DN的防治具有顯著的社會(huì)意義。

在DN的發(fā)生過程中，氧化應(yīng)激現(xiàn)已被認(rèn)為是一重要因素，機(jī)體氧化應(yīng)激的水平上升可促使炎性因子的分泌，反過來，釋放的炎性因子又會(huì)對(duì)氧化應(yīng)激的水平產(chǎn)生影響，進(jìn)而會(huì)加重本病［5-6］。近年來相關(guān)研究表明，Nrf-2/ARE通路在機(jī)體發(fā)生抗氧化應(yīng)激時(shí)發(fā)揮重要作用，若對(duì)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf-2）的表達(dá)進(jìn)行適當(dāng)?shù)母深A(yù)，就可阻斷氧化應(yīng)激相關(guān)通路，阻止相關(guān)疾病的進(jìn)展［7］。丹參屬于傳統(tǒng)中藥唇形科鼠尾草屬，其有除煩安神、祛瘀止痛、涼血消癰及活血等的功用［8］。丹酚酸B則是丹參提取物中的一種，具有調(diào)血脂、抗氧化、抗肝纖維化、改善腎功能及抗炎等的功用［9-12］。當(dāng)前，丹酚酸B對(duì)糖尿病血管病變進(jìn)行的相關(guān)研究主要是抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及調(diào)節(jié)血脂等方面，但其對(duì)抗氧化應(yīng)激方面的研究鮮有報(bào)道［13］。因此，筆者建立大鼠DN模型，觀察不同劑量的丹酚酸B灌胃后，大鼠腎組織中Nrf-2和血紅素加氧酶1（HO-1）表達(dá)的變化，探討丹酚酸B對(duì)DN的抗氧化應(yīng)激作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠40只，8周齡，無特定病原體（SPF）級(jí)，體質(zhì)量（200±10）g，由武漢華聯(lián)科生物公司（批號(hào)：2005416）提供，動(dòng)物于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水、飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要藥品及試劑 丹酚酸B購(gòu)于西安森冉有限公司（1 kg/盒，批號(hào)：2002351）；鏈脲佐菌素（STZ，純度99.9%）購(gòu)于西安熱默爾生物公司（1 g/瓶，批號(hào)：18883664），使用0.1 mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液（pH=4.2）配制STZ工作液（配制后30 min內(nèi)使用完）；實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)血液指標(biāo)（24 h尿蛋白、血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油）的試劑盒及相關(guān)抗體購(gòu)于艾美捷科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用PCR相關(guān)試劑盒購(gòu)于南京一道科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與模型構(gòu)建 按照隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、丹酚酸B組低及高劑量組，每組10只。模型制備：使用大鼠尾靜脈注射STZ（40 mg/kg）并高糖高脂的食物喂養(yǎng)以構(gòu)建DN模型，對(duì)照組使用相同劑量枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行尾靜脈注射且為正常飲食，每日注射1次，連續(xù)1周。72 h取大鼠尾靜脈血以檢測(cè)血糖，當(dāng)隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L或空腹血糖＞7.0 mmol/L，即為糖尿病模型構(gòu)建成功；1周后，檢測(cè)大鼠24 h尿蛋白，當(dāng)濃度＞20 mg/24 h，即為DN模型構(gòu)建成功。藥物處理：丹酚酸B低、高劑量組大鼠于造模成功后分別給予丹酚酸B 10 mg/kg、20 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)6周；對(duì)照組及模型組給予等體積橄欖油灌胃。

1.4 標(biāo)本收集 分組處理6周后，收集大鼠24 h尿液，檢測(cè)24 h尿蛋白，之后采用戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠，采集眼球血與腎組織，分離眼球血血清用以檢測(cè)血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油的含量；腎組織洗凈后分為2份，1份在液氮中速凍后，置于-70℃保存，1份置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)制備石蠟切片。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 取大鼠24 h尿液及血清，分別檢測(cè)24 h尿蛋白及血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油的含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot，WB）法檢測(cè)Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)水平 大鼠冷凍腎組織在液氮中研磨，加入1.5 mL蛋白裂解液，采用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白總量。SDS-PAGE凝膠電泳后，半干法將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h；分別加入鼠抗Nrf-2（1∶500）、HO-1（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）的多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。采用Image-Pro Plus 6.0來檢測(cè)相關(guān)蛋白的灰度值，相對(duì)灰度值=相關(guān)蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法檢測(cè)腎組織中Nrf-2、HO-1 mRNA表達(dá)水平 大鼠冷凍腎組織在液氮中研磨、打碎后-70℃過夜保存，隔日解凍靜置10 min，依次下列操作，加入100 μL氯仿、靜置離心、250 μL異丙醇、靜置離心棄上清、750 μL乙醇、離心棄上清吹干，加入無酶水混勻后檢測(cè)mRNA濃度。mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后（反應(yīng)條件：42℃30 min；85 ℃ 5 min）進(jìn)行PCR。引物：Nrf-2上游5′-GTGCCCT?GTGCAGTTGTG-3′，下游 5′-GATAGGTCGGCGGTTCAT-3′；HO-1 上游 5′-CAGCCACCAACAGTCATCAT-3′，下游 5′-ACTCATCGCTCATCCTTCG-3′；內(nèi)參 GADPH 上游 5′-CTG?GTGTTCGGCTTTCTC-3′，下 游 5′-TTGTGGTCCATCT?CATCG-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。采用Image-Pro Plus 6.0檢測(cè)目的基因mRNA的灰度值并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（目的基因的灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值）。

1.8 PAS染色觀察腎組織病理形態(tài)變化 大鼠腎組織切片進(jìn)行烘片與脫蠟后。按照PAS法染色程序?qū)η衅鸩竭M(jìn)行染色，封片后置于光學(xué)顯微鏡下，觀察腎組織發(fā)生病理改變的程度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組24 h尿蛋白、血清中血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油水平顯著升高；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組上述指標(biāo)均明顯下降，且呈劑量依賴性。見表1。

2.2 各組腎組織中Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA的表達(dá)情況比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織中Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組大鼠腎組織中Nrf-2、HO-1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高，且呈劑量依賴性。見圖1、2，表2、3。

2.3 各組PAS染色結(jié)果的比較 對(duì)照組SD大鼠腎組織未見到異常的病理改變，腎小球毛細(xì)血管正常，基膜未見增厚等現(xiàn)象；與對(duì)照組比較，模型組大部分視野可見到腎小球毛細(xì)血管呈現(xiàn)彌漫性的增厚，腎小球變肥大及基底膜出現(xiàn)增厚；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組大鼠腎組織病理損傷程度均減輕，且呈現(xiàn)出劑量依賴的趨勢(shì)。見圖3。

Fig.1 Comparison of relative expression levels of related proteins between five groups圖1 各組相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

Tab.2 Comparison of relative expression levels of Nrf-2 and HO-1 proteins between five groups表2 各組相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of Nrf-2 and HO-1 proteins between five groups表2 各組相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

組別對(duì)照組模型組t n 10 10 Nrf-2/GAPDH 0.215±0.039 0.453±0.029 15.451＊HO-1/GAPDH 0.314±0.008 0.438±0.043 8.732＊組別模型組低劑量組高劑量組F n 10 10 10 Nrf-2/GAPDH 0.453±0.029 0.635±0.057a 0.863±0.037ab 229.356＊HO-1/GAPDH 0.438±0.043 0.599±0.051a 0.791±0.046ab 138.667＊

3 討論

隨著人類各種生活習(xí)慣的變化及人口的老年化，糖尿病的發(fā)病率正在逐年的上升，早在2010年相關(guān)調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)糖尿病的發(fā)生率已位居全球第一［14］。DN屬于糖尿病中最常見的一種并發(fā)癥，其早期以腎小球的肥大、腎小管與腎小球基底膜的增厚以及基質(zhì)的聚積等病變?yōu)橹?，后期則會(huì)發(fā)生腎小管間質(zhì)或者腎小球的纖維化病變，最為嚴(yán)重的即是導(dǎo)致ESRD［15］。

Tab.1 Comparison of 24-h urine protein,blood glucose,serum creatinine,total cholesterol and triglycerides between five groups表1 各組24 h尿蛋白、血糖、血肌酐、總膽固醇及三酰甘油的比較 （n=10，x±s）

Fig.2 Comparison of relative expression levels of related mRNAs between four groups圖2 各組相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

Tab.3 Comparison of relative expression levels of related mRNAs between five groups表3 各組相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （n=10,±s）

Tab.3 Comparison of relative expression levels of related mRNAs between five groups表3 各組相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （n=10,±s）

組別對(duì)照組模型組t模型組低劑量組高劑量組F Nrf-2/GAPDH 0.307±0.026 0.501±0.040 12.539＊0.501±0.040 0.710±0.032a 0.881±0.040ab 250.277＊HO-1/GAPDH 0.273±0.017 0.416±0.040 10.379＊0.416±0.040 0.628±0.059a 0.751±0.035ab 133.318＊

Fig.3 Comparison of PAS staining results between four groups(×40)圖3 各組PAS染色結(jié)果的比較（×40）

丹參有除煩安神、祛瘀止痛、涼血消癰及活血等功用，對(duì)免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及心腦血管等都可起到一定保護(hù)的作用，已在臨床心絞痛、失眠、肝脾腫大及痛經(jīng)等各種疾病得以應(yīng)用［16-17］。丹酚酸B為丹參中水溶性的成分且有活性，能夠起到調(diào)血脂、抗氧化、抗肝纖維化、改善腎功能及抗炎等的功用，但其在對(duì)抗氧化應(yīng)激方面鮮有研究。

在人體中氧化應(yīng)激實(shí)為一種防御功能，其與機(jī)體發(fā)生的衰老以及某些疾病等之間存在一定關(guān)聯(lián)，如糖尿病、缺血再灌注損害以及認(rèn)知缺失所導(dǎo)致的Alzheimer病等［18］。氧化應(yīng)激現(xiàn)已被認(rèn)為是引發(fā)糖尿病及其出現(xiàn)相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制之一［19］。Nrf-2是機(jī)體進(jìn)行抗氧化應(yīng)答系統(tǒng)中最重要的轉(zhuǎn)錄因子，其是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族（即為CNC）成員中的一個(gè)，在正常的狀態(tài)之下，其可在細(xì)胞質(zhì)中與Keap1發(fā)生結(jié)合，而此時(shí)的Nrf-2處于無活性的狀態(tài)，且處于極易發(fā)生降解的狀態(tài)；如若機(jī)體受到了外界的一些刺激，機(jī)體氧化應(yīng)激被激活，此時(shí)Nrf-2會(huì)與Keap1發(fā)生解離，進(jìn)而處于活化的狀態(tài)，其發(fā)生活化后隨即進(jìn)入到細(xì)胞核中，以調(diào)節(jié)其下游的相關(guān)因子，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，來抵抗外界的刺激［20］。HO-1屬于Nrf-2下游的相關(guān)因子之一，其有抗炎與抗氧化的雙重功用，現(xiàn)已被證明在高血壓、急性肺損傷、敗血癥以及腎損傷等疾病中有一定的保護(hù)能力。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織中Nrf-2、HO-1的蛋白及mRNA表達(dá)量顯著升高；與模型組比較，丹酚酸B低、高劑量組大鼠腎組織中Nrf-2、HO-1的蛋白及mRNA表達(dá)量顯著升高，且呈劑量依賴性，表明丹酚酸B可上調(diào)Nrf-2、HO-1的表達(dá)量以對(duì)DN大鼠起保護(hù)功用，這與24 h尿蛋白、血糖、血肌酐、總膽固醇與三酰甘油含量以及PAS染色的結(jié)果是相符的。

綜上所述，丹酚酸B對(duì)DN大鼠有改善的功用，其可能作用的機(jī)制與上調(diào)腎組織中Nrf-2及HO-1的表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)，且其保護(hù)功用呈現(xiàn)為劑量依賴的趨勢(shì)。但本研究尚不足以證明丹酚酸B在氧化應(yīng)激中的具體作用形式，還需為此進(jìn)行相關(guān)的研究以進(jìn)一步的了解其機(jī)制。除此之外，丹酚酸B可否通過其他的途徑而對(duì)腎臟起到保護(hù)作用，還需深入研究。