移植途徑對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)小鼠心臟移植排斥反應(yīng)的影響

龔勇泉，曹健斌，韋成信，李富驪，黃維佳

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有免疫調(diào)節(jié)功能，器官移植受體接受BMSCs移植后，能夠減少免疫抑制劑的應(yīng)用，甚至誘導(dǎo)免疫耐受［1-3］。但是不同途徑注射BMSCs后，細(xì)胞在體內(nèi)的分布不同，存活時間不同，有可能影響該細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，相關(guān)研究報道較少［4］。因此有必要研究注射途徑對BMSCs調(diào)節(jié)器官移植排斥反應(yīng)的影響，為臨床器官移植領(lǐng)域應(yīng)用BMSCs提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究在頸部心臟移植模型的基礎(chǔ)上，通過移植心臟右心室腔內(nèi)注射、移植心臟升主動脈注射和心肌注射3種不同途徑移植BMSCs，對比觀察移植心臟的存活時間，心臟移植物內(nèi)BMSC的存活情況，移植心臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞比例，心臟的病理改變，比較3種細(xì)胞注射移植途徑的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級近交系C57和BALB/c小鼠各48只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，周齡約6～8周，體質(zhì)量19～24 g，實(shí)驗(yàn)動物的使用嚴(yán)格遵守柳州市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物使用管理規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 C57小鼠綠色熒光骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（eGFP-BMSCs）、小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、胰酶購于賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司，氯胺酮購于福建古田藥業(yè)公司，甲苯噻嗪購于Sigma公司，0.1%Ⅱ型膠原酶購于Invitrogen公司，ACK紅細(xì)胞裂解液、小鼠流式細(xì)胞抗體FITC-CD11b、PerCP-F4/80購于BD公司。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) C57小鼠eGFP-BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志為CD29+、CD44+、CD34+、CD117-、Sca-1+。細(xì)胞加入小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細(xì)胞達(dá)到80%融合時應(yīng)用0.125%胰酶消化傳代，傳至3代后的細(xì)胞可用于細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)。

1.4 小鼠頸部心臟移植模型的建立 供體雄性BALB/c小鼠，受體雄性C57小鼠，麻醉采用腹腔注射100 mg/kg氯胺酮和25 mg/kg甲苯噻嗪的混合液。供體手術(shù)：正中腹部剪開，暴露下腔靜脈，注入4℃肝素生理鹽水1 mL（肝素濃度100 U/mL)，待1 min后橫斷腹主動脈和下腔靜脈全身放血，將皮膚切口延長至頸部，剪開膈肌，沿雙側(cè)腋前線剪開胸廓，將整個胸前壁向上翻起，暴露心臟，局部冰泥降溫。游離上腔靜脈以及下腔靜脈并結(jié)扎離斷，靠近無名動脈處離斷升主動脈，游離肺動脈主干，盡可能靠近分叉處離斷，5-0絲線一次集束結(jié)扎左右肺靜脈、左上腔靜脈，在結(jié)扎線遠(yuǎn)心端剪斷，取出供心，置于預(yù)冷的生理鹽水中。受體手術(shù)：受體小鼠右側(cè)頸部作一反“L”形切口，顯露并切除右側(cè)胸鎖乳突肌，游離右側(cè)頸總動脈以及頸外靜脈，取出供心，將供體升主動脈與受體頸總動脈行端側(cè)吻合，供體肺動脈與受體頸外靜脈行對端吻合。開放血管夾后，可見心臟立即開始跳動，手術(shù)成功，間斷縫合皮膚切口，術(shù)后小鼠單籠喂養(yǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)動物分組以及干細(xì)胞移植 心臟移植手術(shù)成功后，使用隨機(jī)數(shù)字表法將受體小鼠分為A組、B組、C組和D組，每組各12只。A組在移植成功后立即經(jīng)過移植心臟升主動脈注射C57來源eGFP-BMSCs懸液30 μL（含1×106細(xì)胞），B組在同樣時間點(diǎn)經(jīng)過移植心臟右心室腔內(nèi)注射相同數(shù)量細(xì)胞，C組在同樣時間點(diǎn)向移植心臟心肌內(nèi)注射相同數(shù)量細(xì)胞，D組為空白對照組。

1.6 移植物內(nèi)巨噬細(xì)胞比例檢測 移植術(shù)后第7天，每組各處死4只受體小鼠，獲取心臟移植物并橫斷分為上中下3個部分，將下1/3移植心臟剪碎，使用0.1%Ⅱ型膠原酶在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化60 min，70 μm濾網(wǎng)過濾，ACK紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，加入FITC-CD11b，PerCP-F4/80流式細(xì)胞檢測抗體，孵育15 min，PBS沖洗細(xì)胞2次，采用流式細(xì)胞學(xué)檢測移植物內(nèi)巨噬細(xì)胞比例，取4次檢測結(jié)果的平均值為最后結(jié)果。

1.7 病理學(xué)檢測 將切取的移植心臟上1/3部分經(jīng)福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，病理切片，行HE染色，觀察組織病理改變。中1/3部分使用OCT包埋后冰凍切片，在40倍熒光顯微鏡下觀察eGFP-BMSCs細(xì)胞在心臟移植物中的存活情況。

1.8 移植心臟存活時間觀察 術(shù)后每日通過直視和觸診檢查移植心臟的跳動情況，必要時可以將小鼠麻醉后切開皮膚判斷移植心臟的跳動情況，心臟完全停止跳動為移植心臟死亡，記錄移植心臟的存活時間。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 eGFP-BMSCs細(xì)胞的培養(yǎng) 體外培養(yǎng)的BMSCs生長良好，24 h能貼壁生長，48 h細(xì)胞明顯增多，形態(tài)呈梭狀、星形，見圖1a。細(xì)胞傳至第7代時，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞仍呈較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)，見圖1b。

2.2 頸部心臟移植手術(shù)情況 共完成48例小鼠頸部心臟移植，無手術(shù)死亡，移植心臟恢復(fù)血液供應(yīng)后心臟跳動良好。無干細(xì)胞移植后的相關(guān)死亡。術(shù)后受體動物存活良好。

2.3 移植心臟內(nèi)綠色熒光細(xì)胞存活情況 移植術(shù)后第7天，A組移植心臟內(nèi)可見綠色熒光信號，但B組、C組和D組移植心臟內(nèi)未見明顯熒光信號，見圖2。

2.4 流式細(xì)胞檢查結(jié)果 移植術(shù)后第7天，A組移植心臟內(nèi)巨噬細(xì)胞占浸潤白細(xì)胞的比例高于B組、C組和D組，B組和C組明顯高于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），B組和C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.5 移植心臟的病理變化 術(shù)后第7天心臟組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯示，A組移植心臟排斥反應(yīng)受到明顯抑制，間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞浸潤少，局灶性的心肌細(xì)胞損害，見圖3a，B組和C組移植間質(zhì)內(nèi)可見多灶性淋巴細(xì)胞浸潤并伴有心肌細(xì)胞變性壞死，見圖3b、c，D組小鼠心臟呈急性排斥反應(yīng)，滿視野大量白細(xì)胞浸潤，心肌結(jié)構(gòu)消失，心肌壞死，見圖3d。

2.6 移植心臟存活時間 A組移植心臟存活時間長于B組、C組和D組，B組和C組的移植心臟存活時間長于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），B組和C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Comparison of macrophages proportion in the heart graft infiltrating leukocytes and heart graft survival between four groups表1 各組心臟移植物內(nèi)巨噬細(xì)胞的比例以及移植心臟存活時間 （±s）

Tab.1 Comparison of macrophages proportion in the heart graft infiltrating leukocytes and heart graft survival between four groups表1 各組心臟移植物內(nèi)巨噬細(xì)胞的比例以及移植心臟存活時間 （±s）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F巨噬細(xì)胞比例（n=4，%）49.6±4.5 20.4±3.3a 26.8±7.5a 6.3±1.3abc 58.351＊＊移植心臟存活時間（n=8，d）17.6±1.8 12.8±1.6a 12.1±1.9a 7.2±0.9abc 49.335＊＊

3 討論

BMSCs移植途徑常用方法有靜脈注射、移植器官供血動脈注射和移植器官局部注射等。有文獻(xiàn)報道，BMSCs的治療效果受到細(xì)胞注射途徑的影響［5-6］，但是細(xì)胞注射途徑是否影響該細(xì)胞調(diào)節(jié)器官移植免疫排斥反應(yīng)，目前還不清楚，相關(guān)方面的研究較少。

本研究結(jié)果顯示，3種途徑注射BMSCs，均可延長移植心臟的存活時間，但是動脈途徑比靜脈途徑和局部注射效果更顯著，而靜脈途徑和局部注射兩種途徑對比則沒有差異。組織病理學(xué)檢查證實(shí)BMSCs能夠減輕急性排斥反應(yīng)。筆者分析這可能和移植細(xì)胞在體內(nèi)分布不同有關(guān)。動脈途徑注射BMSCs后，大量細(xì)胞直接進(jìn)入心肌微循環(huán)，通過受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入心肌間質(zhì)內(nèi)定植。而移植心臟右心室腔內(nèi)注射細(xì)胞后，細(xì)胞經(jīng)過移植心臟右心室進(jìn)入肺動脈，回流到受體的頸外靜脈，從而進(jìn)入受體的靜脈回流系統(tǒng)，由于肺毛細(xì)血管網(wǎng)的濾過作用，導(dǎo)致大量細(xì)胞滯留于肺內(nèi)，進(jìn)入體循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞大大減少［7］，雖然仍有部分細(xì)胞能通過趨化作用進(jìn)入移植心臟內(nèi)定植，但細(xì)胞數(shù)量對比動脈注射途徑明顯減少。而心肌內(nèi)注射細(xì)胞，細(xì)胞雖然可以直接進(jìn)入心肌組織間隙，但是這種注射方法導(dǎo)致大量細(xì)胞聚集在注射部位附近，引起干細(xì)胞的大量死亡［8］，定植的細(xì)胞較少。熒光顯微鏡證實(shí)了動脈途徑注射后BMSCs存活時間超過7 d，但是靜脈和局部2種方法注射后細(xì)胞存活未能超過7 d，這與BMSCs在移植心臟內(nèi)的定植量有關(guān)，定植細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞存活時間長，因而能更加長久地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，改善細(xì)胞的存活。

本研究還證實(shí)，3種途徑注射BMSCs后，移植物內(nèi)浸潤白細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的比例較對照組明顯增加，動脈途徑較靜脈途徑和心肌內(nèi)注射途徑增加更顯著。筆者分析這與移植心臟內(nèi)定植的BMSCs有關(guān)，移植物內(nèi)的巨噬細(xì)胞來源于供體心臟內(nèi)固有的巨噬細(xì)胞和受體循環(huán)系統(tǒng)的單核細(xì)胞向移植物內(nèi)趨化［9］，供體來源的巨噬細(xì)胞由于急性排斥反應(yīng)而大量死亡，但是移植物內(nèi)的BMSCs能夠減少排斥反應(yīng)導(dǎo)致的移植心臟內(nèi)巨噬細(xì)胞的死亡，同時BMSCs還可以通過修復(fù)移植心臟的損傷，改善細(xì)胞的存活環(huán)境，提高巨噬細(xì)胞的存活率，從而增加了巨噬細(xì)胞的比例。BMSCs不僅通過分泌細(xì)胞因子、與細(xì)胞直接接觸或通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞等多種途徑調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［10］，而且還能在移植心臟內(nèi)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的形成，間接調(diào)節(jié)排斥反應(yīng)［11］，協(xié)同改善移植器官的存活。

總之，本研究證實(shí)了靜脈注射、移植器官供血動脈注射和移植器官局部注射3種方法均能顯著改善小鼠移植心臟的存活時間，但是動脈途徑較靜脈途徑和心肌內(nèi)注射能更加顯著延長移植心臟的存活。其機(jī)制可能和移植心臟內(nèi)BMSCs定植以及移植物內(nèi)浸潤白細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的比例增高有關(guān)。

Fig.1 The 3rdpassage eGFP-BMSCs cell morphology and green fluorescence expression of the 7thpassage（×40）圖1 第3代eGFP-BMSCs細(xì)胞形態(tài)以及第7代細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況（×40）

Fig.2 Green fluorescence cell survival in the heart graft at 7 post-operative day（×40）圖2 心臟移植術(shù)后第7天移植心臟內(nèi)熒光細(xì)胞存活情況（×40）

Fig.3 The heart graft histological changes at 7 days after heart transplant（×40）圖3 心臟移植術(shù)后第7天移植心臟病理學(xué)改變（×40）