四氫姜黃素對壓力負(fù)荷引起的小鼠心肌肥厚的保護(hù)作用

曹星，王玉嶺，翟蒙恩，馬繼鵬，王曉武，馮建宇△

病理性左心室肥大是對心臟應(yīng)對多種刺激或疾病如高血壓、心肌梗死、主動(dòng)脈瓣狹窄、心力衰竭和神經(jīng)激素等的一種病理性反應(yīng)［1］。這些因素最初會(huì)刺激心臟蛋白質(zhì)合成并改善心輸出量，這種情況通常稱為代償性心臟肥大，但持續(xù)的心臟肥大最終會(huì)失代償，引起細(xì)胞死亡和纖維化，導(dǎo)致心力衰竭、猝死和卒中［2］。因此，防治病理性心肌肥厚具有非常重要的臨床意義。研究證實(shí)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑和鈣通道阻滯劑是降低左心室質(zhì)量最有效的藥物［3］。然而，這些外源性生物合成藥物具有明顯的不良反應(yīng)，如干咳、血管性水腫、低血壓癥狀、暈厥、頭暈、頭痛和臉部發(fā)紅等［4-5］，限制了其臨床應(yīng)用。因此亟須尋找新的有效藥物治療病理性心肌肥厚。四氫姜黃素（Tetrahydrocurcumin，THC）是姜黃素在體內(nèi)的主要代謝物之一，具有抗炎、抗氧化和心肌保護(hù)等多種藥理作用［6-7］。特別值得注意的是，THC的生物活性明顯優(yōu)于姜黃素［8］。以往研究證實(shí)，姜黃素能有效緩解壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚［9］，但THC能否減輕壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚尚少見報(bào)道。本研究旨在探究THC能否減輕壓力負(fù)荷引起的病理性心肌肥厚。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。C57BL/6小鼠，雄性，無特定病原體（SPF）級，體質(zhì)量20～22 g，8～10周齡，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境，自由進(jìn)食進(jìn)水。（2）主要試劑。THC、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（Sigma公司）；抗GAPDH、α-肌球蛋白重鏈（α-MHC）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）抗體（Santa-Cruz公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）；羊抗兔、羊抗鼠二抗（北京中杉金橋公司）；心房鈉尿肽（ANP）引物、GAPDH引物（生工生物工程上海股份有限公司）；Minivent 845小動(dòng)物呼吸機(jī)（Harvard Apparatus公司）；Western成像儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad公司）；小動(dòng)物超聲儀（Visualsonic公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、建模及給藥方式 將24只C57BL/6小鼠按照體質(zhì)量編號后用隨機(jī)數(shù)字表完全隨機(jī)分為4組，每組6只，即假手術(shù)（Sham）組、THC組、主動(dòng)脈弓縮窄（TAC）組和TAC+THC組。參考文獻(xiàn)［10］方法，使用微創(chuàng)TAC術(shù)建立小鼠壓力負(fù)荷性心肌肥厚模型。具體操作步驟如下，小鼠用2%異氟烷誘導(dǎo)麻醉；用20 G針頭氣管插管并通氣（Minivent 845）；用1%～2%的異氟烷維持麻醉；在第二肋間做縱向切口（約0.5 cm）并從肋間隙開胸；鈍性分離胸腺、脂肪組織與主動(dòng)脈弓；在無名動(dòng)脈和左頸總動(dòng)脈之間墊27 G針并結(jié)扎主動(dòng)脈弓（7-0絲線）；取出針頭，留下狹窄區(qū)域；逐層關(guān)胸；手術(shù)完成后，將小鼠轉(zhuǎn)移至加熱墊并密切監(jiān)測。Sham組和THC組小鼠進(jìn)行開胸、分離主動(dòng)脈弓、關(guān)胸等操作，但不結(jié)扎主動(dòng)脈弓。術(shù)后THC組和TAC+THC組小鼠通過飲水?dāng)z入THC，給藥劑量為每天120 mg/kg，給藥4周。Sham組和TAC組小鼠術(shù)后自由進(jìn)水4周，飲水內(nèi)不添加THC。

1.2.2 心臟功能檢測 TAC術(shù)后4周，剔除小鼠胸前毛發(fā)。用VEVO 770小動(dòng)物超聲儀檢測左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）與左室短軸縮短率（LVFS）［1］。

1.2.3 心臟/體質(zhì)量比、肺臟/體質(zhì)量比檢測 超聲檢測結(jié)束后，將小鼠安樂死，取出心臟和肺，并測定心臟質(zhì)量（HW）、肺臟質(zhì)量（LW）和體質(zhì)量（BW），計(jì)算心臟/體質(zhì)量比（HW/BW）和肺臟/體質(zhì)量比（LW/BW）。

1.2.4 心肌組織HE染色和Masson染色 將心臟組織浸入10%中性福爾馬林溶液中固定48 h，石蠟包埋。制備5 μm厚的切片并分別用HE染色或Masson三色染色以評估心肌細(xì)胞橫截面積和膠原蛋白沉積情況。每張切片隨機(jī)讀取10個(gè)高倍視野，用Image J軟件對心肌細(xì)胞的平均橫截面積和膠原沉積程度進(jìn)行定量評估。心肌纖維化的主要表現(xiàn)為心肌間質(zhì)內(nèi)膠原沉積增加，本研究通過比較各組小鼠心肌間質(zhì)內(nèi)膠原沉積程度來反映心肌纖維化程度。

1.2.5 Western blotting檢測心肌組織α-MHC和β-MHC蛋白表達(dá) 取各組動(dòng)物心肌組織提取蛋白，提取方法參考文獻(xiàn)［11］。用BCA蛋白定量試劑盒檢測各組樣品蛋白濃度。在電泳加樣孔內(nèi)加入等量蛋白質(zhì)（40 μg），10%Bis/Tris凝膠分離蛋白，并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用TBST（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris，0.1%Tween-20，pH=7.5）稀釋的脫脂牛奶（5%）封閉PVDF膜2 h，孵育抗α-MHC（1∶1 000稀釋）、β-MHC（1∶500稀釋）和GAPDH（1∶1 000稀釋）抗體，4℃過夜；用TBST洗滌3次；室溫孵育對應(yīng)的二抗（1∶5 000稀釋）1.5 h；用TBST洗滌3次。使用Bio-Rad成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)條帶并使用Image Lab軟件定量。GAPDH作為內(nèi)部參照。

1.2.6 Real-time PCR技術(shù)檢測心肌組織ANP mRNA表達(dá)情況 在收集組織后，根據(jù)說明書的要求，使用TRIzol試劑（Invitrogen公司）提取小鼠左心室組織總RNA，繼而將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用CFX96-C1000儀進(jìn)行real-time PCR。ANP引物序列：上游5′-GTGCGGTGTCCAACACAGAT-3′，下游 3′-GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC-5′。GAPDH 引物序列：上游 5′-AGAACATCATCCCTGCATCC-3′，下游 3′-AGTTGCTG TTGAAGTCGC-5′。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。計(jì)算各組樣本熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值），通過2-△△Ct法計(jì)算基因相對表達(dá)量。各組基因表達(dá)量以Sham組的相對值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，差異性分析采用2×2析因設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THC可改善壓力負(fù)荷引起的心臟功能不全 TAC術(shù)后4周，各組小鼠典型超聲心動(dòng)圖表現(xiàn)見圖1。與Sham組相比，TAC組小鼠LVEF與LVFS明顯降低（P＜0.05）。與TAC組相比，TAC+THC組LVEF與LVFS明顯升高（P＜0.05）；與Sham組相比，單純給予THC對小鼠心臟功能無明顯影響，見圖1、表1。

Fig.1 Representative echocardiography of mice in four groups圖1 各組小鼠典型超聲心動(dòng)圖

Tab.1 Effects of THC treatment on cardiac function following transverse aortic constriction表1 THC處理對主動(dòng)脈弓縮窄后心臟功能的影響（n=6）

2.2 THC可減輕心肌肥厚和肺淤血 TAC術(shù)后4周，與Sham組相比，TAC組小鼠HW/BW、LW/BW及心肌細(xì)胞平均橫截面積明顯增高（P＜0.05）。與TAC組相比，TAC+THC組HW/BW、LW/BW及心肌細(xì)胞平均橫截面積明顯降低（P＜0.05）。與Sham組相比，單純給予THC對小鼠HW/BW、LW/BW及心肌細(xì)胞平均橫截面積無明顯影響，見圖2、表2。

2.3 THC可緩解壓力負(fù)荷引起的心肌纖維化 各組小鼠心肌組織典型Masson染色見圖3。Masson染色結(jié)果顯示，Sham組、THC組、TAC組和TAC+THC組的心肌纖維化比例分別為0.45±0.25、0.62±0.45、7.18±1.35和3.35±1.04。THC、TAC因素的作用和TAC+THC交互效應(yīng)的F值分別為21.176、141.155和25.201，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與Sham組小鼠相比，單純給予THC對心肌組織膠原沉積無明顯影響。TAC組小鼠心肌組織內(nèi)膠原沉積程度較Sham組明顯加重（P＜0.05），而給予THC處理可以明顯降低TAC術(shù)后膠原纖維沉積程度（P＜0.05）。

Fig.2 Representative HE staining images of heart tissue of mice in four groups(×400)圖2 各組小鼠心肌組織典型HE染色圖像（×400）

Tab.2 Effects of THC treatment on HW/BW ratio,LW/BW ratio,the mean cross-sectional area of cardiomyocytes following transverse aortic constriction表2 THC處理對主動(dòng)脈弓縮窄后心臟/體質(zhì)量比、肺臟/體質(zhì)量比、心肌細(xì)胞平均橫截面積的影響 （n=6）

2.4 THC處理逆轉(zhuǎn)α-MHC/β-MHC比例倒置，降低心衰標(biāo)志性分子ANP mRNA表達(dá) TAC術(shù)后4周，與Sham組相比，TAC組小鼠心肌組織中α-MHC蛋白表達(dá)量明顯下降，而β-MHC蛋白和ANP mRNA表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）；與TAC組相比，TAC+THC組心肌組織內(nèi)α-MHC蛋白表達(dá)明顯升高，β-MHC蛋白和ANP mRNA表達(dá)則明顯下降（P＜0.05）。與Sham組相比，單純給予THC處理對α-MHC和β-MHC蛋白表達(dá)水平以及ANP mRNA表達(dá)水平無明顯影響，見圖4、表3。

3 討論

Fig.3 Representative Masson staining images of heart tissue of mice in four groups(×200)圖3 各組小鼠心肌組織典型Masson染色圖像（×200）

Fig.4 Representative Western blottings of α-MHC and β-MHC protein expression in heart tissue of mice in four groups圖4 各組小鼠心肌組織α-MHC和β-MHC蛋白表達(dá)免疫印跡

Tab.3 Effects of THC treatment on the expression levels of α-MHC,β-MHC and ANP following transverse aortic constriction表3 THC處理對主動(dòng)脈弓縮窄后α-MHC、β-MHC和ANP表達(dá)的影響 （n=6）

心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因。壓力負(fù)荷引起的病理性心肌肥厚的重要病理改變是心肌重塑，主要包括心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化和心臟功能障礙等［12］。目前臨床上已經(jīng)應(yīng)用β受體阻滯劑［13］、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑［14］、血管緊張素受體拮抗劑［15］和鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑［16］以及心臟再同步［17］等多種藥物和治療手段用于改善心功能，抑制甚至逆轉(zhuǎn)重塑。盡管如此，許多終末期心力衰竭患者最終需要進(jìn)行心臟移植［18］。因此，亟須尋找新的有效藥物用于改善壓力負(fù)荷引起的病理性心肌重塑，改善患者預(yù)后。THC是姜黃素在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物之一。以往研究發(fā)現(xiàn)，THC具有明顯的心肌保護(hù)作用。Lau等［19］發(fā)現(xiàn)，日常飲食攝入THC可以明顯抑制腎大部切除術(shù)引起的腎臟組織纖維化和心肌肥厚。Ali等［20］證實(shí)THC可明顯減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。但THC能否抑制壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚尚鮮見報(bào)道。

病理性心肌肥厚的標(biāo)志性改變之一是心肌組織發(fā)生肥大，即心肌質(zhì)量明顯增大［1］。筆者通過小鼠主動(dòng)脈弓縮窄模型建立壓力超負(fù)荷引起的心臟肥大和心力衰竭模型，以確定THC治療是否可以逆轉(zhuǎn)心臟擴(kuò)大，結(jié)果顯示，與TAC組相比，THC給藥可以明顯降低心臟/體質(zhì)量比、縮小心肌細(xì)胞平均橫截面積，提示THC能夠有效減輕壓力負(fù)荷引起的心肌肥大反應(yīng)。此外，THC還可降低肺臟/體質(zhì)量比，提示THC能夠減輕壓力負(fù)荷引起的肺淤血。

哺乳動(dòng)物心臟中特異性地表達(dá)2種肌球蛋白重鏈亞型，即α-MHC和β-MHC，且其表達(dá)量隨病理生理?xiàng)l件的變化而變化［21］。在成人心臟中表達(dá)的肌球蛋白重鏈亞型主要為α-MHC，因?yàn)棣?MHC比β-MHC具有更強(qiáng)的ATP酶活性［22］。而胚胎期心臟組織中主要表達(dá)β-MHC。與相關(guān)研究結(jié)論一致［23］，本研究觀察到與正常心臟相比，肥大心臟中的α-MHC蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，伴隨著β-MHC蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；通過給予THC治療可逆轉(zhuǎn)由TAC引起的α-MHC向β-MHC表達(dá)的轉(zhuǎn)變。此外，ANP是目前心衰的標(biāo)志性分子之一［24］，通過檢測ANP的表達(dá)情況，本研究進(jìn)一步證實(shí)，THC可以明顯降低TAC引起的ANP mRNA表達(dá)水平增高。

壓力超負(fù)荷引起的心臟重塑的另一標(biāo)志是心臟纖維化［25］。過量膠原沉積可損傷心肌舒張功能和收縮功能，引發(fā)室性快速性心律失常并最終導(dǎo)致心力衰竭［26］。本研究通過心肌組織Masson染色證實(shí)THC可以有效改善壓力負(fù)荷引起的心肌纖維化反應(yīng)。有充分研究證據(jù)顯示，心臟纖維化是導(dǎo)致心臟功能不全的重要誘因［27］。本研究通過檢測各組小鼠心臟收縮功能發(fā)現(xiàn)，THC能夠明顯改善TAC引起的心臟功能受損。

綜上所述，本研究證實(shí)THC能夠明顯改善壓力負(fù)荷引起的心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化，緩解心肌重塑，進(jìn)而改善心臟功能，為臨床上應(yīng)用THC治療壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚患者提供了理論依據(jù)。