微小RNA-375調(diào)控自噬抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖和轉(zhuǎn)移

王星星，宋虎，杜晨陽，王振，張建軍△，沈中陽

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的85%～90%，并且是全球惡性程度最高的癌癥之一，經(jīng)常在晚期發(fā)現(xiàn)并且預(yù)后不良［1-3］。手術(shù)切除和肝移植是HCC的主要治療手段，但即使手術(shù)切除后，HCC患者的5年生存率仍然不高，侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響臨床治療和預(yù)后的主要因素［4］。微小RNA（microRNA，miRNA）異常表達(dá)涉及許多人類疾病，特別是癌癥［5］。自噬（Autophagy）是一種細(xì)胞內(nèi)降解過程，已被證明在多種生物功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞存活、神經(jīng)元功能、線粒體翻轉(zhuǎn)、蛋白質(zhì)降解和能量代謝等［6］。有證據(jù)表明自噬可以通過其降解過程保護(hù)HCC細(xì)胞免于由抗腫瘤劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，自噬可能促進(jìn)HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移［7］。本研究旨在探索miR-375介導(dǎo)Atg14調(diào)控自噬對肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人SMMC-7721肝癌細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫；miR-375引物、miR-375模擬物（miR-375 mimic）、miR-375抑 制 物（miR-375 inhibitor）、Atg14的小干擾 RNA（siRNA）購自廣州銳博生物科技公司；Atg14引物購自上海生工生物工程公司；胎牛血清（FBS）、培養(yǎng)基、胰酶購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3）購自上海漢恒生物科技公司；qRT-PCR儀器購自瑞士Roche公司；Nanodrop分光光度計(jì)和CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；兔抗鼠泛素結(jié)合蛋白（P62）、Atg14、酵母Atg6同源物（Beclin1）、N-鈣黏素（NCadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國CST公司，兔抗鼠輕鏈3（LC3）Ⅰ/Ⅱ多克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型建立及分組 培養(yǎng)人SMMC-7721肝癌細(xì)胞并傳代，將處于對數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化后接種至6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞融合度為70%左右。分別用miR-375 mimics、miR-375 inhibitor、對照miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及Atg14 siRNA、對照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為miR-375 NC組、miR-375 mimics組、miR-375 inhibitor組以及siRNANC組、Atg14 siRNA組。各組轉(zhuǎn)染后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后移除培養(yǎng)基，加入2 mL Hank’s培養(yǎng)液，放入模擬缺氧專用培養(yǎng)箱，模擬缺血（缺氧）狀態(tài)。1 h后移去Hank’s液，加入2 mL完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，模擬再灌注（復(fù)氧）狀態(tài)。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-375以及Atg14 mRNA的表達(dá)情況 Trizol法提取miR-375 NC、miR-375 mimics及miR-375 inhibitor組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA（根據(jù)操作說明書進(jìn)行）。miR-375引物：上游5′-CCCGCGCGAGCCCGA?CAAACGC-3′，下游 5′-UCGUUUGUCGGGCUCGCGUGGG-3′；Atg14引物：上游5′-CATAACAACCCCGCCTACAC-3′，下游5′-TGCGTTCAGTTTCCTCACTG-3′；內(nèi)參GAPDH引物：上游 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游 5′-GGCT?GTTGTCATACTTCTCATGG-3′。按說明書配制反應(yīng)體系，經(jīng)過94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。結(jié)果使用比較閾值法定量分析，計(jì)算方法為：目的基因定量拷貝數(shù)=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組，對每一標(biāo)本計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué) 經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后的miR-375 NC、miR-375 mimics及miR-375 inhibitor組細(xì)胞用胰酶消化，重新接種于24孔板中。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，室溫下4%多聚甲醛固定20 min，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶15 min，5%山羊血清封閉1 h，孵育一抗N-Cadherin、β-catenin（1∶500稀釋）在4℃環(huán)境過夜。室溫下孵育二抗1 h。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色、蘇木精染核后光鏡顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot） 各組細(xì)胞加入裂解液，充分裂解后用4℃，12 000 r/min，離心15 min，吸取上清。BCA法蛋白定量。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉，加LC3、P62、Atg14、Beclin1、N-Cadherin、Vimentin、β-catenin與內(nèi)參蛋白GAPDH一抗（1∶1 000稀釋），4℃環(huán)境下孵育過夜，TBST洗滌后HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2 500）室溫孵育1 h，混合等體積的化學(xué)發(fā)光液與PVDF膜反應(yīng)，曝光并保存圖片。采用圖像分析軟件Image J對Western blot實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果圖像進(jìn)行灰度分析，自噬過程中，LC3Ⅰ和磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w（即LC3Ⅱ），因此以LC3Ⅱ作為自噬標(biāo)記蛋白。所有結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參對照，結(jié)果用灰度比值表示。

1.2.5 自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3）檢測自噬體 將人SMMC-7721肝癌細(xì)胞接種至24孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為50%～70%，用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染miR-375 NC、miR-375 mimics和miR-375 inhibitor組細(xì)胞，并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體情況。記錄每個(gè)細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量，比較組間細(xì)胞自噬表達(dá)情況。

1.2.6 平板克隆 分別用miR-375 mimics、miR-375 inhibitor、Atg14 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，分為miR-375 NC組、miR-375 mimics組、miR-375 inhibitor組以及siRNA-NC組、Atg14 siRNA組和miR-375+Atg14 siRNA共轉(zhuǎn)組。將miR-375 NC組、miR-375mimics組、miR-375 inhibitor組和siRNA NC組、Atg14 siRNA組以及miR-375+Atg14 siRNA組均按相同密度接種在6孔板中（每孔加500個(gè)細(xì)胞），放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周后用結(jié)晶紫溶液（0.1%結(jié)晶紫）染色后觀察并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-375和Atg14 mRNA的表達(dá) 通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan 7.2進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-375與Atg14的相關(guān)性評分均較高，且有相互結(jié)合的序列，見圖1。通過轉(zhuǎn)染miR-375 mimics、miR-375 inhibitor以及對照miRNA結(jié)果顯示，與miR-375 inhibitor組以及miR-375 NC組比較，miR-375 mimics組中miR-375 mRNA的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Atg14 mRNA在miR-375 mimics組表達(dá)最低，在miR-375 inhibitor組表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Detection of miR-375 mRNA and Atg14 mRNA expression in cells by qRT-PCR表1 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-375 mRNA和Atg14 mRNA的表達(dá) （n=4，±s）

Tab.1 Detection of miR-375 mRNA and Atg14 mRNA expression in cells by qRT-PCR表1 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-375 mRNA和Atg14 mRNA的表達(dá) （n=4，±s）

＊＊P＜0.01；a與miR-375 NC組比較，b與miR-375 inhibitor組比較，P＜0.05

組別miR-375 NC組miR-375 inhibitor組miR-375 mimics組F miR-375 mRNA 1.00±0.00 0.41±0.14a 2.62±0.59ab 42.213＊＊Atg14 mRNA 1.00±0.00 2.30±0.55a 0.48±0.14ab 32.372＊＊

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測SMMC-7721細(xì)胞中NCadherin、β-catenin表達(dá)情況 與miR-375 inhibitor組以及miR-375 NC組比較，miR-375 mimics組的β-catenin胞漿表達(dá)明顯增多，而N-Cadherin的胞漿表達(dá)明顯減少，見圖2。

2.3 Western blot檢測SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 過表達(dá)miR-375導(dǎo)致LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)降低，P62的蛋白表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與miR-375 inhibitor組、miR-375 NC組比較，miR-375 mimics組Atg14、Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3、表2。

2.4 自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3）檢測自噬體 miR-375 mimics組自噬體個(gè)數(shù)（4.25±1.26）明顯低于 miR-375 NC組（8.25±1.26），而 miR-375 inhibitor組自噬體個(gè)數(shù)（16.75±2.50）明顯高于miR-375 NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=4，F(xiàn)=48.531，P＜0.01），見圖4。

Fig.1 TargetScan 7.2 forecast results圖1 TargetScan 7.2預(yù)測結(jié)果

2.5 平板克隆 與miR-375 inhibitor組（154.00±6.48）、miR-375 NC組（100.25±3.59）比較，miR-375 mimics組（29.25±2.99）的細(xì)胞集落明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=4，F(xiàn)=736.061，P＜0.01）。與siRNA NC組（144.25±8.85）相比，Atg14 siRNA組（48.00±10.23）細(xì)胞集落減少，且在miR-375 mimics與Atg14 siRNA共同轉(zhuǎn)染后（29.25±5.19）細(xì)胞集落減少更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=4，F(xiàn)=217.70，P＜0.01），見圖5。

2.6 Western blot檢測干擾Atg14表達(dá)后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 Atg14 siRNA組N-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯低于siRNA-NC組，β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯高于siRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6、表3。

Fig.2 Immunocytochemical detection of N-Cadherin and β-catenin expression in SMMC-7721 cells（×400）圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測SMMC-7721細(xì)胞中N-Cadherin、β-catenin表達(dá)情況（×400）

Fig.3 Western blot analysis of related protein expressions圖3 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

Tab.2 Relative expression levels of related proteins after SMMC-7721 cell transfection表2 SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染后相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量（n=4，±s）

Tab.2 Relative expression levels of related proteins after SMMC-7721 cell transfection表2 SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染后相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量（n=4，±s）

＊＊P＜0.01；a與miR-375 NC組比較，b與miR-375 inhibitor組比較，P＜0.05

組別miR-375 NC組miR-375 inhibitor組miR-375 mimics組F LC3Ⅱ0.57±0.07 1.33±0.22a 0.29±0.06ab 61.777＊＊P62 0.59±0.12 0.20±0.02a 0.87±0.09ab 58.228＊＊Atg14 0.29±0.04 0.37±0.02a 0.11±0.02ab 97.504＊＊Beclin1 0.30±0.01 0.41±0.05a 0.21±0.03ab 36.747＊＊

Fig.4 Autophagy double-labeled adenovirus(mRFP-GFP-LC3)for detection of autophagosomes（×400）圖4 自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3）檢測自噬體（×400）

Fig.5 Changes in cell proliferation in each treatment group圖5 各處理組細(xì)胞增殖變化情況

Fig.6 Western blot analysis of the expression of related proteins after interference with Atg14 expression圖6 Western blot檢測干擾Atg14表達(dá)后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

Tab.3 Relative expression of target protein after interference with Atg14 expression表3 干擾Atg14表達(dá)后目的蛋白的相對表達(dá)量（n=4，±s）

Tab.3 Relative expression of target protein after interference with Atg14 expression表3 干擾Atg14表達(dá)后目的蛋白的相對表達(dá)量（n=4，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別siRNA-NC組Atg14 siRNA組t N-Cadherin 1.51±0.13 0.77±0.04 11.143＊＊Vimentin 1.09±0.06 0.68±0.05 5.195＊β-catenin 0.26±0.05 1.30±0.08 22.486＊＊

3 討論

自噬是細(xì)胞應(yīng)激條件下的重要生存機(jī)制，miRNA調(diào)控自噬在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用［8］。Yuan等［9］通過研究紫外線輻射耐受相關(guān)基因（UVRAG）和UVRAG靶向miRNA對胃癌自噬和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)miR-183通過靶向人胃癌細(xì)胞中的UVRAG，抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬和細(xì)胞凋亡。Hua等［10］證實(shí)miR-1過表達(dá)可通過抑制Atg3介導(dǎo)的自噬來改善非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞對順鉑（Cisplatin）的化療敏感性。而Liu等［11］通過研究miR-92b在乳腺癌自噬、增殖和侵襲中的主要作用，發(fā)現(xiàn)miR-92b的過表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞中饑餓和雷帕霉素處理誘導(dǎo)的自噬。本研究表明，過表達(dá)miR-375能抑制Atg14表達(dá)，進(jìn)而降低肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的表達(dá)；反之抑制miR-375表達(dá)能促進(jìn)Atg14表達(dá)，進(jìn)而提高肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成和LC3Ⅱ、Beclin1的表達(dá)；說明miR-375能通過負(fù)性調(diào)控Atg14以抑制肝癌細(xì)胞自噬。

miRNA對肝細(xì)胞癌的調(diào)控作用同樣具有雙面性。Liang等［12］發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中miR-29a下調(diào)及干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白-3（IFITM3）上調(diào)，miR-29a可通過負(fù)性調(diào)控IFITM3抑制HCC細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。Wang等［13］研究結(jié)果表明miR-506能特異性地靶向調(diào)控Yes相關(guān)蛋白（YAP）mRNA的3′-UTR區(qū)，抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。而Xu等［14］報(bào)道了miR-589-5p通過靶向有絲分裂誘導(dǎo)基因6（MIG-6）促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長，抑制miR-589-5p可能是抑制肝癌進(jìn)展的可行方法。Hu等［15］研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞和組織中miR-665表達(dá)量顯著增加，miR-665通過抑制蛋白酪氨酸磷酸酶受體B（PTPRB）靶向抑制Hippo信號傳導(dǎo)活性，最終發(fā)揮促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-375在多種類型的癌癥中顯著下調(diào)，如肝細(xì)胞癌、食管癌、胃癌、頭頸部癌、黑色素瘤、胰腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤［16］。Yan等［16］研究顯示miR-375可以抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化，并因此阻斷自噬體的形成，此過程使溶酶體融合用于降解和再循環(huán)。此外，Liu等［17］也發(fā)現(xiàn)miR-375在HCC中顯著下調(diào)，并且miR-375的過表達(dá)通過靶向調(diào)控另一種重要癌基因YAP來降低HCC細(xì)胞的侵襲和增殖。本研究表明，過表達(dá)miR-375可抑制肝癌細(xì)胞增殖，抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力；反之抑制miR-375表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，提高肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；說明miR-375具有抗肝癌作用。

miRNA調(diào)控自噬作用于肝癌的機(jī)制復(fù)雜，可通過多種信號通路或靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，如Atg、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）通路等［18］。Wang等［19］研究結(jié)果表明miR-7通過靶向調(diào)控mTOR介導(dǎo)的自噬抑制肝癌細(xì)胞增殖，通過抑制自噬來增強(qiáng)miR-7的抗腫瘤活性。Zhang等［20］研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)miR-142-3p表達(dá)可靶向miR-142-3p-ATG5/ATG16L1軸以減少索拉非尼誘導(dǎo)的自噬，增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長，使肝癌細(xì)胞對索拉非尼敏感。Atg基因在自噬的激活和發(fā)生中起關(guān)鍵作用［21］。Si等［22］通過研究miR-23a對由敗血癥引發(fā)的自噬的作用，發(fā)現(xiàn)miR-23a在膿毒性損傷后被抑制，且能促進(jìn)自噬并抑制高度炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步的研究證實(shí)Atg12是miR-23a的靶標(biāo)。Li等［23］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Atg14為miR199a-5p的特異性靶點(diǎn)，并且Atg14部分地增強(qiáng)了miR199a-5p-增強(qiáng)的肝臟對葡萄糖和胰島素的耐受性。本研究通過TargetScan預(yù)測miR-375與Atg14具有高度的基因相關(guān)性；過表達(dá)miR-375可使Atg14表達(dá)量降低，肝癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力降低，反之，肝癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力升高；使用RNA干擾抑制Atg14表達(dá)可使miR-375對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用增強(qiáng)；說明Atg14是miR-375調(diào)控自噬作用于肝癌細(xì)胞的重要中間靶點(diǎn)，受miR-375且介導(dǎo)的自噬影響肝癌細(xì)胞。

綜上所述，與正常肝細(xì)胞相比，miRNA-375在肝癌細(xì)胞中表達(dá)更低，且通過靶向下調(diào)Atg14抑制自噬，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮抗腫瘤作用。miRNA-375靶向調(diào)控自噬抑制肝細(xì)胞癌為肝細(xì)胞癌的臨床治療提供了新思路。