高鹽對血管內(nèi)皮生長因子受體-3+巨噬細胞表型及功能的影響

余芳芳，楊國紅，李銘，陶燕燕，王秀娟，牛秀瓏，李玉明，趙季紅

血管內(nèi)皮生長因子受體-3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）陽性單核巨噬細胞是一群具有潛在淋巴管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化功能的特殊細胞群，其在一定條件下可遷移到組織中，分泌血管內(nèi)皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C），并能轉(zhuǎn)化為淋巴管內(nèi)皮細胞而促進淋巴管的生成［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)，長期的高鹽刺激可以通過張力應(yīng)答性增強子結(jié)合蛋白（tonicityresponsive enhancer binding protein，TonEBP）/VEGFC/VEGFR-3信號通路引起自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）心肌間質(zhì)淋巴管的增生，通過上調(diào)VEGF-C的表達在促進淋巴管明顯增生的同時，可使SHR血壓水平及左心室重塑程度得以改善［2］。而VEGFR-3+單核巨噬細胞是否參與了淋巴管生成的病理生理過程，目前尚不清楚。本研究利用流式分選技術(shù)將RAW264.7巨噬細胞中VEGFR-3+亞群分選出來，觀察高鹽刺激對VEGFR-3+單核巨噬細胞的表型、淋巴管內(nèi)皮細胞特性及功能的影響，為進一步探討VEGFR-3+單核巨噬細胞亞群在高鹽誘導(dǎo)的高血壓靶器官損傷中的作用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 小鼠RAW264.7巨噬細胞株由本實驗室提供；胎牛血清（FBS）、高糖培養(yǎng)基（DMEM）購自Gibco公司；Flt-4熒光標記的山羊抗小鼠VEGFR-3（VEGF-R3/Flt-4）抗體購自R&D Systems公司；TRIzol購自TAKARA公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green實時定量PCR試劑購自Roche公司；CCK-8購自碧云天公司；ABI 7300熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；流式細胞儀Cytomics FC 500和BD FACSAriaTMⅢ（Beckman Coulter公司）；Transwell購自 Costar公司；EZCellTMPhagocytosis Assay Kit購自Bio Vision公司；酶標儀購自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞分選VEGFR-3+巨噬細胞 將RAW264.7細胞置于含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中，5%CO2、37℃條件下，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。計數(shù)后取1.0×107個細胞離心（1 000 r/min，5 min）棄上清，加1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 2次；棄上清，分別加入VEGFR-3抗體75 μL，Staining Buffer 50 μL，PBS 70 μL，避光孵育 15 min，隨后以1.3 mL細胞染色緩沖液重懸細胞，上機檢測。根據(jù)表達的VEGFR-3的熒光強度不同可以將RAW264.7細胞分為兩群，應(yīng)用Flow Jo 7.6.1軟件對流式數(shù)據(jù)進行分析，見圖1。

Fig.1 The gating strategy used for analysis of the VEGFR-3+macrophages圖1 VEGFR-3+巨噬細胞流式細胞分選的設(shè)門方法

1.2.2 Real-time PCR 將VEGFR-3+巨噬細胞按照每皿1.0×106濃度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 h待細胞貼壁。分別設(shè)溶劑對照組（Control組），高鹽（high salt，HS，40 mmol NaCl）組，低鹽（low salt，LS，20 mmol NaCl）組，培養(yǎng)24 h，收取細胞后按照TRIzol說明書提取各組細胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real-time PCR檢測相關(guān)基因的mRNA表達水平。Real-time PCR反應(yīng)條件：50℃2 min；95℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，30個循環(huán)。設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)3次。2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達情況：ΔΔCt=實驗組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）-對照組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。檢測所用引物見表1。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活性 將對數(shù)生長期的VEGFR-3+巨噬細胞接種于96孔板（100 μL/孔，約5×103個細胞）按1.2.2中分組方法，每組設(shè)5復(fù)孔，重復(fù)3次。待細胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，棄培養(yǎng)基，加入CCK-8溶液（10 μL/孔），孵育2～4 h后，使用酶標儀在450 nm處測定光密度（OD）值，細胞活力計算公式：細胞活力（%）=（加藥細胞OD-空白OD）/（對照細胞OD-空白OD）×100%。

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移能力 選用8 μm孔徑的遷移小室，下室加入含10%血清的完全培養(yǎng)基600 μL，上室加200 μL（1×105個）無血清重懸的對數(shù)生長期細胞，按1.2.2中分組方法，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h。將小室取出，觀察下室壁細胞數(shù)≥10個貼壁、伸展細胞，用蘸濕的棉簽將小室上表面細胞輕輕擦拭干凈后，在無水乙醇中固定10 min，0.4%臺盼藍染色30 min，1×PBS清洗。顯微鏡下對聚碳酸酯膜下表面的細胞進行計數(shù)。隨機讀取5個視野，計數(shù)每個視野細胞數(shù)目。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞吞噬能力 將對數(shù)生長期VEGFR-3+巨噬細胞接種于12孔板，按1.2.2中分組方法，待細胞干預(yù)至22 h和46 h，將細胞消化、離心，棄上清；每孔加入200 μL培養(yǎng)基，5 μL綠色酵母多糖（Green Zymosan）重懸，孵育2 h；再次離心、重懸，加入300 μL與干預(yù)時相同藥物濃度的吞噬作用測定緩沖液清洗3次，加入緩沖液1 mL上機。實驗重復(fù)3次。

Tab.1 The specific primer sequences of mononuclear macrophage in Real-time PCR表1 單核巨噬細胞Real-time PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間多重比較使用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高鹽對VEGFR-3+巨噬細胞表型及淋巴管內(nèi)皮細胞特性的影響 與Control組相比，LS組、HS組的M1型巨噬細胞標志物TNF-α、CCL2、IL-1β mRNA表達水平顯著上調(diào)，代表M2型巨噬細胞標志物的Ym1、IL-10、Arg-1 mRNA表達水平減低（P＜0.05）；與Control組相比，HS、LS組的淋巴管標志物TonEBP、VEGF-C mRNA 表達水平上調(diào)（P＜0.05），Prox-1、LYVE-1、Podoplanin mRNA表達水平下調(diào)（P＜0.05）。與LS組相比，HS組的M1型巨噬細胞標志物TNF-α、IL-1β mRNA表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），HS組的淋巴管標志物 VEGF-C、TonEBP mRNA表達水平上調(diào)（P＜0.05）。高鹽刺激下VEGFR-3+巨噬細胞表現(xiàn)出促淋巴管內(nèi)皮細胞生成的特性，但并未表現(xiàn)出淋巴管內(nèi)皮細胞的特性，見表2。

2.2 高鹽刺激對VEGFR-3+巨噬細胞的活性的影響 與Control組、LS組相比，干預(yù)24、48 h，HS組的VEGFR-3+巨噬細胞的活性明顯降低（P＜0.05），見表3。

2.3 高鹽對VEGFR-3+巨噬細胞的遷移功能的影響 與Control組相比，干預(yù)24 h后，LS組、HS組VEGFR-3+巨噬細胞遷移能力均增強（P＜0.05）；與Control組相比，干預(yù)48 h后，HS組VEGFR-3+巨噬細胞遷移能力明顯增強（P＜0.05）；LS組與HS組相比差異無統(tǒng)計學意義，見圖2，表4。

Fig.2 ThemigrationabilityofdifferentgroupsbyTranswellassay（×200）圖2 Transwell實驗檢測各干預(yù)組細胞的遷移能力（×200）

Tab.2 The comparison of 24 h mRNA expression levels between three groups表2 各組細胞24 h mRNA表達水平的比較結(jié)果 （n=3,±s）

Tab.2 The comparison of 24 h mRNA expression levels between three groups表2 各組細胞24 h mRNA表達水平的比較結(jié)果 （n=3,±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與LS組比較，P＜0.05

組別Control組LS組HS組F淋巴管標志物M1型巨噬細胞標志物TNF-α 1.00±0 1.63±0.13a 2.31±0.27ab 44.360＊＊CCL2 1.00±0 2.84±0.60a 4.15±1.14a 13.643＊＊IL-1β 1.00±0 1.97±0.03a 3.43±0.28ab 175.816＊＊M2型巨噬細胞標志物Ym1 1.00±0 0.13±0.08a 0.32±0.18a 48.367＊＊IL-10 1.00±0 0.23±0.13a 0.51±0.17a 28.468＊＊Arg-1 1.00±0 0.46±0.16a 0.47±0.33a 6.488＊VEGF-C 1.00±0 2.17±0.28a 3.10±0.57ab 25.057＊＊TonEBP 1.00±0 1.55±0.10a 2.16±0.05ab 261.575＊＊Prox-1 1.00±0 0.24±0.01a 0.68±0.10a 120.505＊＊LYVE-1 1.00±0 0.25±0.11a 0.46±0.22a 21.560＊＊Podoplanin 1.00±0 0.34±0.30a 0.37±0.43a 19.743＊＊

Tab.3 Comparison of the viability of VEGFR-3+cells between three groups表3 各組VEGFR-3+細胞的活性比較結(jié)果 （n=5,±s）

Tab.3 Comparison of the viability of VEGFR-3+cells between three groups表3 各組VEGFR-3+細胞的活性比較結(jié)果 （n=5,±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與LS組比較，P＜0.05

組別Control組LS組HS組F 24 h 1.00±0 0.93±0.19 0.65±0.07ab 12.976＊＊48 h 1.00±0 0.71±0.05a 0.56±0.08ab 83.838＊＊

Tab.4 The migration ability of different groups by Transwell assay表4 Transwell檢測各干預(yù)組細胞的遷移能力（n=3,±s）

Tab.4 The migration ability of different groups by Transwell assay表4 Transwell檢測各干預(yù)組細胞的遷移能力（n=3,±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與Control組比較，P＜0.05

組別Control組LS組HS組F 24 h細胞遷移數(shù)（個）251.00±2.65 265.11±6.38a 273.56±6.70a 12.618＊＊48 h細胞遷移數(shù)（個）261.00±4.62 271.44±8.44 282.00±4.84a 8.551＊

2.4 高鹽刺激對VEGFR-3+巨噬細胞吞噬能力的影響 與Control組相比，干預(yù)24、48 h后，HS組細胞的吞噬能力增強（P＜0.05）；與LS組相比，干預(yù)24、48 h，HS組細胞的吞噬能力增強（P＜0.05），見圖3，表5。

Tab.5 The phagocytosis ability of different groups by flow cytometry表5 流式細胞儀檢測各干預(yù)組細胞的吞噬能力（n=5，%，±s）

Tab.5 The phagocytosis ability of different groups by flow cytometry表5 流式細胞儀檢測各干預(yù)組細胞的吞噬能力（n=5，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較；b與LS組比較，P＜0.05

組別Control組LS組HS組F 24 h 4.42±1.03 5.12±1.69 9.10±1.94ab 12.472＊＊48 h 4.57±0.67 7.86±2.09a 11.50±2.03ab 20.115＊＊

3 討論

Fig.3 The phagocytosis ability of different groups by flow cytometry圖3 流式細胞儀檢測各干預(yù)組細胞的吞噬能力（n=5）

單核巨噬細胞主要來源于骨髓、外周血以及組織中。大量研究證實，單核巨噬細胞在表型和功能上存在異質(zhì)性［3］。根據(jù)狀態(tài)功能不同巨噬細胞激活后分化為經(jīng)典激活的巨噬細胞（classically activated macrophage，caMφ/M1型）及替代性激活的巨噬細胞（alternatively activated macrophage，aaMφ/M2 型）［4］。M1型巨噬細胞具有極強的抗原呈遞、促進炎癥反應(yīng)的能力并產(chǎn)生大量炎性因子；M2型巨噬細胞具有抑制炎癥、改善組織修復(fù)進程的能力［5-6］。前期研究顯示，不同的單核細胞亞群其生理功能及病理作用存在差異，其中高鹽攝入能夠引起人外周血中間型單核細胞CD14+CD16+亞群數(shù)量及比例增加并伴隨炎癥相關(guān)因子表達上調(diào)、靶器官損傷［7-8］。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR-3+巨噬細胞在高鹽刺激后向M1型巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化，M2型巨噬細胞標志物基因表達水平減低，提示短期的高鹽刺激使VEGFR-3+巨噬細胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的功能增強。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞具有多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)因素作用下可分化為不同的細胞，如T淋巴細胞、血管內(nèi)皮細胞等；炎癥刺激下單核細胞有向淋巴管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化的可能性［9］。研究表明，外周血中有一部分幼稚單核細胞構(gòu)成性的表達VEGFR-3［1］。單核細胞能夠在炎癥刺激下分泌VEGF-C，其與VEGFR-3結(jié)合刺激淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、遷移并促進淋巴管增生；也可通過形成細胞聚集體嵌入淋巴管壁直接參與新淋巴管內(nèi)皮細胞的生成，稱為單核巨噬細胞的轉(zhuǎn)分化作用［1，10］。本研究利用流式細胞術(shù)將VEGFR-3+巨噬細胞分選出來，給予高鹽刺激后，發(fā)現(xiàn)其VEGF-C表達水平明顯增高，提示該群單核巨噬細胞在短期高鹽刺激下主要誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖，與前述研究相一致，長期慢性高鹽刺激是否會誘導(dǎo)該群細胞轉(zhuǎn)分化為淋巴管內(nèi)皮細胞，還需要進一步研究去證實。

由TonEBP誘導(dǎo)產(chǎn)生的VEGF-C是重要的促淋巴管生成因子。前期研究發(fā)現(xiàn)，長期的高鹽攝入可引起小鼠心肌單核巨噬細胞浸潤以及TonEBP/VEGF-C介導(dǎo)產(chǎn)生淋巴管，廣泛增生的淋巴管系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)高鹽誘導(dǎo)的血壓變化和水鹽代謝的平衡［11-13］。本研究顯示，短期的高鹽刺激引起VEGFR-3+巨噬細胞TonEBP和VEGF-C表達水平的顯著增加，與上述研究相一致；本研究結(jié)果提示在高鹽刺激下TonEBP/VEGF-C/VEGFR-3通路的激活可能在VEGFR-3+巨噬細胞轉(zhuǎn)分化作用中占有重要地位。

細胞的活性是其發(fā)揮免疫功能的基礎(chǔ)。巨噬細胞內(nèi)各種因子的表達水平或活性的改變影響細胞增殖、吞噬、遷移、分泌細胞因子和趨化因子的能力，從而調(diào)節(jié)其免疫功能［14］。高鹽干預(yù)產(chǎn)生的高滲應(yīng)激會引起細胞發(fā)生DNA斷裂等損傷性改變以及滲透壓保護性反應(yīng)，這兩條相對的細胞信號通路間的平衡決定了細胞存活或凋亡［15］。高鹽產(chǎn)生的高滲狀態(tài)下，細胞活力明顯降低；鹽濃度降低，細胞活力增強。

在各種組織損傷的情況下，巨噬細胞需要進行增殖并向損傷區(qū)遷移，對外來異物或死亡宿主細胞進行吞噬。活化的巨噬細胞分泌的因子能調(diào)動其他粒細胞和淋巴細胞，共同促進局部及全身的炎癥反應(yīng)，進而發(fā)揮抗原提呈的作用［16］。在參與機體炎癥反應(yīng)的過程中，巨噬細胞的遷移功能是實現(xiàn)其參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵［17］。因此，高鹽干預(yù)下，觸發(fā)巨噬細胞釋放大量的炎癥因子，使其遷移細胞數(shù)量增多，遷移能力增強；吞噬率可直接反映其吞噬功能，高鹽干預(yù)下，細胞的吞噬能力增強，而低鹽狀態(tài)下則減弱［18］。

總之，本研究表明高鹽刺激使VEGFR-3+巨噬細胞向M1型巨噬細胞偏移，其吞噬及遷移能力明顯增強，并具有促淋巴管內(nèi)皮細胞增殖的特性，為進一步研究該亞群與淋巴管生成及心血管疾病的關(guān)系提供了依據(jù)。