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    五味子乙素抑制晶狀體氧化損傷的實驗研究

    2018-12-27 11:27:34王輝李璐劉平劉娟
    中國中醫(yī)眼科雜志 2018年6期
    關(guān)鍵詞:乙素離體五味子

    王輝,李璐,劉平,劉娟

    隨著年齡增加或者日照時間延長,積累性氧化損傷引起過氧化氫(H2O2)過度產(chǎn)生,大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)、羥基自由基及離子代謝產(chǎn)物堆積,導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡,引發(fā)白內(nèi)障[1]。五味子乙素(schisandrin B,Sch B)由于其具有強大的抗氧化、抗炎、降血糖、改善微循環(huán)和抗腫瘤作用而被用于治療各種全身性疾病[2-3]。然而,關(guān)于五味子乙素對白內(nèi)障大鼠晶狀體保護作用的研究并不多見。本研究通過制備氧化損傷誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠模型,觀察五味子乙素對白內(nèi)障大鼠晶狀體的保護作用,并初步探討其作用機制,為治療白內(nèi)障提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及主要材料

    4周齡清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只,體質(zhì)量(200±20)g,購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物研究中心。五味子乙素(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所),H2O2(上海試劑總廠),血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)、核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子 2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf-2)抗體 (上海碧云天公司),Medium 199(M199)培養(yǎng)基 (美國GIBCO公司),手術(shù)顯微鏡(Leica),二喹啉甲酸(bicichoninic acid,BCA)蛋白測定試劑盒、聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride,PVDF)膜及化學(xué)發(fā)光試劑(上海碧云天公司)。

    1.2 實驗方法

    晶狀體分離及培養(yǎng) 實驗動物脫臼處死,無菌操作取雙側(cè)眼球,生理鹽水、青霉素(80萬 U/500 mL)及慶大霉素(8萬 U/500 mL)沖洗數(shù)分鐘后,在手術(shù)顯微鏡下用晶狀體圈匙游離晶狀體組織,置入含有1.5mLM199的24孔培養(yǎng)板中,每孔1只晶狀體。

    分組處理 隨機數(shù)字法將晶狀體分為4組,每組20只??瞻讓φ战M:單純M199培養(yǎng)基1.5 mL+青霉素及鏈霉素各300 U;五味子乙素組:空白對照組培養(yǎng)液1.35 mL+5 mmol/L五味子乙素0.15 mL;氧化損傷組:空白對照組培養(yǎng)液1.35 mL+1 mmol/L H2O20.15 mL;氧化損傷+五味子乙素組:氧化損傷組培養(yǎng)液1.35 mL+5 mmol/L五味子乙素0.15 mL。分別在晶狀體培養(yǎng)后6 h、12 h及24 h觀察晶狀體混濁程度并拍照。

    晶狀體透明度觀察記錄方法在白色背景下設(shè)計粗細(xì)一致的十字交叉黑色線條,所檢查的晶狀體放置在十字交叉處,根據(jù)透過晶狀體所能看到的線條清晰度進行分級:“-”:晶狀體透明,線條清晰可見;“+”:線條增粗,模糊,但是完全可見;“++”:只有晶狀體中央部可見線條輪廓。

    透射電子顯微鏡觀察晶狀體超微結(jié)構(gòu) 培養(yǎng)24 h完成拍照后,每組隨機取10只晶狀體,手術(shù)顯微鏡下小心撕取晶狀體前囊膜,晶狀體組織固定于2.5%戊二醛溶液中,4℃冰箱過夜,PBS沖洗后1%四氧化鋨后固定,梯度脫水后包埋劑包埋,做超薄切片,檸檬酸鉛和醋酸鈾染色5 min。

    Western blot檢測HO-1及Nrf-2的蛋白表達(dá)量完成前述晶狀體前囊膜取材后,研磨剩余的晶狀體組織,RIPA裂解液提取總蛋白后,用BCA蛋白測定試劑盒測定濃度,電泳分離蛋白及轉(zhuǎn)膜后分別加入一抗、二抗,采用增強化學(xué)發(fā)光法曝光顯影并掃描灰度,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參,比較各組HO-1及Nrf-2的相對表達(dá)量。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。晶狀體混濁程度組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。HO-1及Nrf-2相對表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 晶狀體透明度

    整體上,各組晶狀體透明度均有隨時間延長逐漸下降的趨勢。同一時間點比較,空白對照組及五味子乙素組差異較小(P>0.05),培養(yǎng) 6 h、12 h 后以“-”晶狀體為主,培養(yǎng)24 h后以“-”“+”為主;氧化損傷+五味子乙素組3個時點的“-”晶狀體比例均低于空白對照組及五味子乙素組,但組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);氧化損傷組各時點“+”“++”晶狀體比例高于其他各組,其中與空白對照組及五味子乙素組的差異最明顯(P<0.05)(表 1)。

    圖1為培養(yǎng)24 h后,各組典型樣本的檢查圖片。空白對照組及五味子乙素組晶狀體透明,可以清晰看到晶狀體下方的十字線,氧化損傷組晶狀體透明度明顯降低,晶狀體下方的十字線增粗、模糊,僅晶狀體中央部隱約可見線條輪廓,而氧化損傷+五味子乙素組晶狀體混濁情況明顯輕于氧化損傷組。

    2.2 晶狀體超微結(jié)構(gòu)

    培養(yǎng)后24 h后,透射電子顯微鏡觀察晶狀體內(nèi)超微結(jié)構(gòu)改變??瞻讓φ战M及五味子乙素組晶狀體上皮細(xì)胞胞膜完整連續(xù),核仁形態(tài)規(guī)則,呈圓形或橢圓形;氧化損傷組晶狀體上皮細(xì)胞呈彌漫性改變,胞膜殘缺不全,胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡變性,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、裂解,細(xì)胞核體積縮小,部分核碎裂;氧化損傷+五味子乙素組多數(shù)晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)改變輕微,染色質(zhì)凝聚或成塊,可看到連續(xù)的核膜結(jié)構(gòu)(圖2)。

    表1 各組SD大鼠晶狀體離體培養(yǎng)不同時間后透明度分級比較(眼只數(shù))

    圖1 各組SD大鼠晶狀體離體培養(yǎng)24 h后透明度比較。以在白色背景下黑色十字交叉線條評價透明度,1A.空白對照組,1B.五味子乙素組,晶狀體透明;1C.氧化損傷組,十字線增粗、模糊,僅晶狀體中央部隱約可見線條輪廓;1D.氧化損傷+五味子乙素組,晶狀體混濁情況明顯輕于氧化損傷組

    圖2 各組SD大鼠晶狀體離體培養(yǎng)24 h后晶狀體組織透射電鏡像(×500)。2A.空白對照組,晶狀體上皮細(xì)胞胞膜完整連續(xù),核仁形態(tài)規(guī)則,呈圓形或橢圓形;2B.五味子乙素組,晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)沒有明顯改變;2C.氧化損傷組,晶狀體上皮細(xì)胞呈彌漫性改變,胞膜殘缺不全,胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡變性,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、裂解,細(xì)胞核體積縮小,部分核碎裂;2D.氧化損傷+五味子乙素組,多數(shù)晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)改變輕微,染色質(zhì)凝聚或成塊,可看到連續(xù)的核膜結(jié)構(gòu)

    2.3 晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)HO-1及Nrf-2表達(dá)

    氧化損傷組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中HO-1及Nrf-2的蛋白表達(dá)量明顯低于空白對照組及五味子乙素組(P<0.05);氧化損傷+五味子乙素組大鼠晶狀體中HO-1及Nrf-2的蛋白表達(dá)量較空白對照組及五味子乙素組降低(P>0.05),但高于氧化損傷組(P<0.05)(表2)??梢?,五味子乙素能使受氧化損傷晶狀體上皮細(xì)胞的抗氧化酶HO-1及Nrf-2的蛋白表達(dá)增加,提示五味子乙素對H2O2引起的晶狀體氧化損傷有一定的保護作用。胞自身抗氧化防御系統(tǒng)、延緩白內(nèi)障的發(fā)生是一個合理的防治策略[7-8]。

    五味子乙素是一種從五味子果實中提取的有效單體,有很強的抗氧化作用,能維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整,減少活性氧生成,增強細(xì)胞的抗氧化能力,在臨床上廣泛用于心腦血管病的治療[9-10]。近年來,已有學(xué)者將五味子乙素引入到眼科疾病治療中[11]。本課題旨在研究五味子乙素對大鼠晶狀體上皮細(xì)胞的作用,明確五味子乙素是否能改變晶狀體上皮細(xì)胞中HO-1、Nrf-2的表達(dá),抑制氧自由基導(dǎo)致

    圖3 Western Blot法檢測各組SD大鼠離體培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)HO-1及Nrf-2蛋白表達(dá)的電泳圖 HO-1:血紅素加氧酶-1 Nrf-2:核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

    表2 各組SD大鼠離體培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)HO-1及Nrf-2 蛋白相對表達(dá)量比較()

    表2 各組SD大鼠離體培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)HO-1及Nrf-2 蛋白相對表達(dá)量比較()

    注:HO-1及Nrf-2測定以GAPDH為內(nèi)參。單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。與空白對照組比較,aP<0.05;與五味子乙素組比較,bP<0.05;與氧化損傷組比較,cP<0.05 HO-1:血紅素加氧酶-1 Nrf-2:核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

    0.99±0.07 1.08±0.09 0.42±0.11ab 0.82±0.18c F值P值組別 樣本量 HO-1 Nrf-2空白對照組五味子乙素組氧化損傷組氧化損傷+五味子乙素組10 10 10 10 1.02±0.17 1.14±0.16 0.33±0.14ab 0.78±0.13c 69.87 0.013 63.76 0.006

    3 討論

    多項研究證實,氧化應(yīng)激是白內(nèi)障發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。通常情況下,自由基的生成與氧代謝之間處于動態(tài)平衡狀態(tài),一旦這種平衡破壞,過量產(chǎn)生的自由基便會引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[4-5]。大量的氧代謝產(chǎn)物導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)或DNA氧化損傷,對細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性作用[6]。

    雖然手術(shù)可以治愈白內(nèi)障,但是,由于醫(yī)療資源分布不均衡,很多地區(qū)缺乏必要的手術(shù)器械,一些地方醫(yī)院面臨手術(shù)醫(yī)生短缺的問題,難以滿足大量患者的醫(yī)療需求。因此,有必要開發(fā)延緩白內(nèi)障發(fā)展的藥物。使用抗氧化劑和某些代謝受體激動劑加強細(xì)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡,從而進一步拓寬五味子乙素的臨床應(yīng)用領(lǐng)域。

    國內(nèi)外學(xué)者嘗試了大量方法,模擬白內(nèi)障的發(fā)生機理誘導(dǎo)晶狀體組織凋亡,如化學(xué)藥物、紫外線照射、H2O2等[12-13]。本實驗中,我們參考既往學(xué)者制備過氧化氫誘導(dǎo)鼠白內(nèi)障方法,建立大鼠白內(nèi)障模型[14-15],觀查五味子乙素對晶狀體上皮細(xì)胞的保護作用。觀察結(jié)果顯示,氧化損傷組晶狀體透明度明顯下降,氧化損傷+五味子乙素組的透明度好于氧化損傷組,提示五味子乙素的干預(yù)對維持晶狀體的透明度有保護作用。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,五味子乙素可以改善晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài),進一步證實了藥物對白內(nèi)障發(fā)生的抑制作用。

    本實驗中,我們采用1 mmol/L H2O2作為誘發(fā)因素引起晶狀體氧化損傷,H2O2可引起大量自由基的產(chǎn)生,導(dǎo)致晶狀體內(nèi)處于氧化應(yīng)激狀態(tài),抗氧化平衡機制受到破壞,我們同時測定了HO-1以及Nrf-2的蛋白含量。HO-1是細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的一種抗氧化酶,幾乎分布于所有的組織和器官,Nrf-2是已知的HO-1的上游調(diào)控因子,Nrf-2在體內(nèi)可被氧化應(yīng)激及其他反應(yīng)組分廣泛激活,對機體的氧化應(yīng)激損傷具有保護作用。結(jié)果顯示,五味子乙素能使受氧化損傷晶狀體的抗氧化酶HO-1及Nrf-2的表達(dá)增加,提示五味子乙素對H2O2引起的晶狀體氧化損傷有一定的保護作用。

    由此可見,五味子乙素對晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷具有抑制化作用,其作用機制可能與上調(diào)HO-1及Nrf-2的表達(dá)有關(guān)。五味子乙素作為一種單體類藥物,其細(xì)胞毒性未見文獻(xiàn)報道,鑒于其臨床應(yīng)用的有效性及安全性,我們認(rèn)為,五味子乙素有望成為治療白內(nèi)障的有效藥物。

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