凋亡相關(guān)蛋白SMAC的表達與非小細胞肺癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系△

陳康，艾孜子·阿不來提，王小雷

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院胸外科，烏魯木齊830000

肺癌在全球具有較高的發(fā)病率，其病死率在中國居惡性腫瘤首位，非小細胞肺癌是肺癌中最常見的一種類型。肺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后與多種因素有關(guān)，但受限于患者的個體差異，即便是同一病理類型，接受相同化療方案的患者，其生存期也不盡相同。因此，尋找一種與非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)的生物因子進行有效治療是十分必要的[1]。隨著人們對非小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等認知的加深，有學(xué)者提出細胞凋亡缺陷或受阻是腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的一個重要因素[2]。第二個線粒體衍生的半胱天冬酶激活蛋白（second mitochondrial activator of caspase，SMAC）是近年來發(fā)現(xiàn)的線粒體膜間隙蛋白，該蛋白被證實具有調(diào)節(jié)細胞凋亡的功效，且在正常細胞中不會引起凋亡[3]。當細胞受到凋亡刺激時，SMAC會從線粒體中釋放到細胞質(zhì)中，與凋亡抑制蛋白（inhibi-tor of apoptosis protein，IAP）結(jié)合后，通過去除IAP對半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的抑制作用，從而促進細胞凋亡[4]。本研究通過免疫組化法檢測非小細胞肺癌組織和癌周肺組織中SMAC的表達情況，旨在探討SMAC蛋白表達與非小細胞肺癌臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年2月至2014年2月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)的67例非小細胞肺癌患者的非小細胞肺癌組織標本。納入標準：①均經(jīng)病理學(xué)診斷確診為非小細胞肺癌；②無其他器官和系統(tǒng)器質(zhì)性病變；③無自身免疫性疾病或嚴重基礎(chǔ)性疾病；④術(shù)前未接受放療、化療及靶向治療等；⑤術(shù)后均采用統(tǒng)一的治療方案；⑥年齡50～70歲；⑦配合生存期等資料的收集工作。排除標準：①術(shù)前接受放療、化療或靶向治療；②合并自身免疫性疾病或嚴重的基礎(chǔ)疾??；③年齡＞70歲或＜50歲；④不能配合接受調(diào)查隨訪。67例非小細胞肺癌患者中，男性44例，女性23例；年齡50～70歲，中位年齡63歲；腫瘤直徑≥3 cm 43例，腫瘤直徑＜3 cm 24例；鱗癌30例，腺癌37例；TNM分期：I期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期25例，Ⅳ期22例。另外，選取本組67例非小細胞肺癌患者的癌周肺組織作為研究參照。全部標本均于10%的福爾馬林溶液固定和石蠟包埋處理。以電話查詢和復(fù)診記錄對患者進行為期3年的調(diào)查隨訪，以手術(shù)日期為隨訪起始時間，每隔6個月對患者進行1次電話隨訪，2017年2月為隨訪終止時間，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意，所有患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

KD-2850低溫恒冷切片機購自浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社，電熱恒溫箱購自杭州艾普儀器設(shè)備有限公司，電磁爐購自東莞菱戈蘭電子科技有限公司，精密電子天平購自瑞士梅特勒-托利多集團；SMAC鼠抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling Biotechnology公司，通用型免疫組織化學(xué)試劑盒及顯色劑均購自基因科技（上海）有限公司，無水乙醇購自上海東羿化工有限公司，蘇木素購自天津市賽瑞達生物工程有限公司，鹽酸購自濟寧汶上縣長浩商貿(mào)有限公司，二甲苯購自青島錦鵬化工有限公司，氯化鈉購自廊坊鵬彩精細化工有限公司，磷酸氫二鈉、枸櫞酸鈉均購自南京化學(xué)試劑股份有限公司，中性樹脂購自北京益利精細化學(xué)品有限公司。

1.3 實驗方法

組織標本解凍，制成石蠟切片，厚度4 μm，進行SMAC的免疫組織化學(xué)法（Elivision）染色；60℃加熱切片4 h，之后經(jīng)二甲苯脫蠟和自來水沖洗2～3 min；抗原修復(fù)：500 ml乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修復(fù)液（pH=9.0）中將切片持續(xù)加熱20 min，室溫條件下自然冷卻；取出切片，分別用蒸餾水和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗2～3次；3%過氧化氫去離子水中浸泡10 min，再次PBS漂洗5 min；紗布擦干標本切片，滴加SMAC鼠抗人單克隆抗體（1∶400），孵育60 min，PBS沖洗；滴加PV-9000免疫組化試劑盒中的增強劑，于28℃條件下孵育60 min，PBS沖洗；滴加PV-9000免疫組化試劑盒中二抗，孵育60 min，PBS沖洗；加入DAB顯色液，待顯微鏡下觀察著色后，用去離子水沖洗，終止染色；蘇木素染色，流水反藍15 min；乙醇脫水后，二甲苯中浸泡，自然風(fēng)干；中性樹脂封片，400×高倍鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果判定[5-6]

SMAC蛋白免疫組織化學(xué)法染色為黃色或棕黃色顆粒，表達于細胞質(zhì)中。染色強度和陽性細胞所占比例由兩名病理科醫(yī)師進行綜合評定，分別在顯微鏡下選取5個高倍視野，記錄染色強度和陽性細胞所占比例。染色強度：無著色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分；陽性細胞所占比例：無陽性細胞記為0分，陽性細胞所占比例＜1%記為1分，陽性細胞所占比例為1%～10%記為2分，陽性細胞所占比例為11%～33%記為3分，陽性細胞所占比例為34%～67%記為4分，陽性細胞所占比例為68%～100%記為5分。最終評分為陽性細胞所占比例得分與染色強度得分的總和：0～2分為陰性（-），3～4分為弱陽性（+），5～6分為中等陽性（++），7～10分為強陽性（+++）；其中（-～++）為低表達，（+++）為高表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMAC表達水平的比較

肺癌組織中SMAC陽性表達50例，陽性表達率為74.6%（50/67），其中SMAC高表達18例，SMAC低表達49例；癌周肺組織中SMAC陽性表達39例，陽性表達率為58.2%（39/67）。肺癌組織中SMAC的陽性表達率高于癌周肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.048，P=0.044）。（表1）

表1 SMAC蛋白在不同組織中的表達情況

2.2 SMAC蛋白表達與非小細胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率分別高于TNM分期為I～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、性別、吸煙史、組織分化程度、腫瘤直徑、組織類型和腫瘤位置的非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC蛋白表達情況的比較（ n=67）

2.3 生存情況的比較

對患者進行為期3年的隨訪，中位隨訪時間為18個月，隨訪結(jié)果顯示：SMAC低表達患者的中位生存期為15.6個月（95%CI：13.68～16.92），3年生存率為36.7%；SMAC高表達患者的中位生存期為13.9個月（95%CI：10.65～14.31），3年生存率為33.3%。Log-rank檢驗結(jié)果顯示，SMAC低表達與SMAC高表達患者的3年生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.066，P=0.797）。（圖1）

圖1 SMAC低表達（ n=49）與SMAC高表達（ n=18）患者的生存曲線

3 討論

肺癌具有極高的發(fā)病率和病死率，中國每年因肺癌死亡的人數(shù)較多且在逐年增高，目前肺癌已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)亟待攻克的重點和難點問題[7]。臨床治療肺癌主要包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療等方法，其中手術(shù)治療的效果最佳，但超過50%的患者在確診時已經(jīng)失去了手術(shù)切除的機會?；熓茄娱L晚期肺癌患者生存時間的主要手段，但化療效果容易受腫瘤異質(zhì)性和化療耐藥性的影響，使得化療效果的個體差異較大，為了避免聯(lián)合化療或大劑量化療給患者正常組織細胞造成的不必要損傷，臨床上亟需尋找新的抗腫瘤靶點，開發(fā)腫瘤特異性化療藥物。細胞凋亡調(diào)控是近年來抗腫瘤藥物研發(fā)的重點領(lǐng)域，細胞凋亡是指由基因控制的細胞自主性程序死亡。細胞凋亡具有維持機體發(fā)育分化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要作用。一旦細胞凋亡系統(tǒng)受到抑制便會引起細胞凋亡減少及細胞過度增殖，從而引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。SMAC是近年來發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡蛋白，有研究認為SMAC蛋白是腫瘤基因治療的潛在靶點，并通過實驗證實SMAC蛋白具有增強腫瘤細胞對凋亡刺激敏感度的作用[9]。Fulda等[10]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，SMAC可明顯增加腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡，且對正常的組織細胞不具有細胞毒作用。蔡增琰[11]研究認為，SMAC蛋白的表達水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈負相關(guān)，并推測SMAC蛋白的表達可能影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。趙寶峰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，SMAC蛋白高表達可以提高γ射線對宮頸癌HeLa細胞的生長抑制率，促進γ射線誘導(dǎo)的HeLa細胞的凋亡進程。因此，明確SMAC蛋白在腫瘤細胞中的特異性表達，可能有助于推進未來腫瘤基因診斷和治療的研究進程。

SMAC是目前發(fā)現(xiàn)的存在于哺乳動物細胞內(nèi)的可以直接抑制IAP的一種蛋白，其在人類睪丸中的表達水平最高，在肺部、腦部、胸腺中的表達水平較低[13]。SMAC基因由7個外顯子組成，位于12號染色體長臂，轉(zhuǎn)錄后形成的SMAC蛋白共有184個氨基酸[14]。SMAC蛋白根據(jù)自身形態(tài)可以分為單體和二聚體，其中單體SMAC蛋白不具有促凋亡作用，二聚體SMAC又稱野生型SMAC，位于線粒體膜間隙內(nèi)，具有調(diào)節(jié)損傷細胞凋亡的功效。研究認為，SMAC的促凋亡機制與caspase分子有關(guān)，caspase在激活機體內(nèi)細胞凋亡通路中起著核心作用，二聚體SMAC蛋白在細胞凋亡的早期可通過消除IAP家族成員對caspase 3、caspase 7、caspase 9的抑制，激活Procaspase和caspase的酶活性，引起caspase 3、caspase 7和caspase 9相繼被激活并發(fā)生caspase的級聯(lián)放大效應(yīng)，從而起到促凋亡作用[15-16]。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測非小細胞肺癌患者肺癌組織和癌周肺組織標本中的SMAC表達情況，并分析其表達水平與非小細胞肺癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中SMAC的陽性表達率高于癌周肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示SMAC蛋白在肺癌組織中的表達水平高于癌周肺組織，SMAC陽性可用于非小細胞肺癌的輔助診斷；本研究結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率分別高于TNM分期為I～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），但不同年齡、性別、吸煙史、組織分化程度、腫瘤直徑、組織類型和腫瘤位置非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果提示SMAC可能對非小細胞肺癌的發(fā)展起到促進作用。本研究結(jié)果看似有悖于常規(guī)的促凋亡理論，因為理論上SMAC高表達被認為是能促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤進展的，然而腫瘤惡性程度不斷發(fā)展的過程中，其壞死組織也在不斷增加，因此可以推測在非小細胞肺癌惡性程度逐漸增高的過程中，細胞凋亡活性可能會隨著細胞增殖活性的增強而增強。本研究對SMAC蛋白表達與非小細胞肺癌患者預(yù)后關(guān)系的分析結(jié)果顯示，SMAC蛋白低表達患者的3年生存率與SMAC蛋白高表達患者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示SMAC不能作為非小細胞肺癌患者預(yù)后的獨立影響因素。葉聞遠等[17]同樣在報道中指出，SMAC與非小細胞肺癌患者的預(yù)后無關(guān)。但因本研究中采用免疫組織化學(xué)法檢測SMAC蛋白的表達水平，易受多種因素干擾，可能影響結(jié)果的準確性。同時，本研究樣本量較少，后續(xù)研究中應(yīng)擴大樣本量，平衡各因素，完善研究方案。

綜上所述，SMAC在肺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者肺癌組織中SMAC的陽性表達率分別高于TNM分期為I～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，因此進一步研究其在肺癌患者體內(nèi)的表達規(guī)律變化可在一定程度上反映肺癌的發(fā)展情況，同時可作為肺癌的輔助診斷手段；但SMAC在肺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的生理作用及其機制有待進一步研究，以期開辟腫瘤治療的新途徑。