新生大鼠高膽紅素血癥腦組織Bcl-2表達及干預(yù)研究

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高膽紅素血癥(hyperbilirubinemia)是新生兒期的一種常見疾病，對新生兒影響較大，嚴(yán)重者可因并發(fā)膽紅素腦病(bilirubin encephalopathy)造成不可逆腦損傷，并遺留多種后遺癥，甚至可造成新生兒死亡，給家庭和社會帶來沉重負擔(dān)[1]。因此，闡明新生兒高膽紅素血癥腦損傷發(fā)病機制，為臨床診治新生兒高膽紅素血癥提供理論依據(jù)具有重要意義。關(guān)于腦出血、缺血再灌注等顱腦損傷的研究表明，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialotetrahexosylganglioside，GM1)對多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有腦保護作用[2]。但GM1是否對新生兒高膽紅素血癥腦損傷具有治療作用，其具體機制目前仍不清楚。本研究目的是觀察高膽紅素血癥時以及應(yīng)用GM1干預(yù)后，新生大鼠腦組織細胞凋亡和Bcl-2表達的情況，以期為新生兒高膽紅素血癥的診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選擇健康的7日齡清潔級SD新生大鼠120只，雌雄不限，體重14 g～18 g，反應(yīng)良好，購于山西醫(yī)科大學(xué)生理實驗室。

1.1.2 主要試劑 晶體膽紅素、GM1、兔抗大鼠Bcl-2抗體、SABC免疫組化試劑盒、生物素化羊抗小鼠IgG抗體、DAB顯色試劑、乙醚、二甲苯、苯胺藍、10%多聚甲醛，以上試劑購自博士德生物技術(shù)公司太原分公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 將120只健康SD大鼠隨機分為對照組、模型組、干預(yù)組3組，各40只。各組根據(jù)造模后動物處死時間不同隨機分為6 h組、12 h組、24 h組、48 h組、72 h組5個亞組，每組8只。

1.2.2 注射用膽紅素溶液的配制 參考陳舜年等[3]提供的方法配制膽紅素溶液，晶體膽紅素20.0 mg，避光稱取，溶于1 mL氫氧化鈉溶液(0.5 mol/L)中，加入雙蒸水9 mL，用氯化氫溶液(0.5 mol/L)將pH調(diào)節(jié)至8.5。

1.2.3 模型制作及干預(yù)方法 新生大鼠高膽紅素血癥模型的制作參照文獻[4]方法制備，模型組大鼠腹腔注射膽紅素溶液(100 μg/g)，對照組大鼠腹腔注射生理鹽水(100 μg/g)，注射完畢后回到原來的飼養(yǎng)環(huán)境中，繼續(xù)由母鼠喂養(yǎng)。GM1制劑用2 mL注射用水溶解。干預(yù)組在模型建立后即刻給予腹腔注射GM1，劑量為10 mg/(kg·d)，給藥時間為每日1次，注射3 d，然后回到原來的飼養(yǎng)環(huán)境中，繼續(xù)由母鼠喂養(yǎng)。

1.2.4 大鼠腦組織的提取及標(biāo)本制備 根據(jù)實驗方案，在各個規(guī)定時間點將大鼠用乙醚吸入麻醉，之后將麻醉的大鼠固定在手術(shù)板上，打開胸腔，充分暴露心臟，用改造過的20 mL注射器(在注射器針頭處連接穿刺針)由左心室小心插入心腔，剪斷頸外靜脈，同時將滅菌生理鹽水注入左心室，當(dāng)有清亮液體從頸外靜脈流出時，停止灌流滅菌生理鹽水。隨后再灌流20 mL～30 mL10%多聚甲醛。停止灌流后，打開顱骨取出腦組織，用生理鹽水清洗腦組織表面并用濾紙吸干，從視交叉及其后5 mm處將一側(cè)腦組織做冠切(海馬區(qū))，切取組織塊的大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，隨后將其置于10%多聚甲醛中固定，然后標(biāo)本經(jīng)常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后用石蠟包埋。最后將標(biāo)本在超薄輪轉(zhuǎn)切片機上進行連續(xù)冠狀切片，厚度約為4 μm，最后于載玻片上70 ℃烘片2 h～4 h。

1.2.5 大鼠腦組織染色 常規(guī)石蠟包埋與切片、烘片、常規(guī)脫蠟及水化、蘇木素伊紅(HE)染色、封片，在光鏡下觀察各組大鼠腦組織的病理學(xué)形態(tài)改變。

1.2.6 大鼠腦組織Bcl-2測定 免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry)檢測Bcl-2，按試劑盒提供的步驟進行操作。光學(xué)顯微鏡下觀察陽性細胞表達。

1.2.7 腦細胞凋亡檢測 用Tunel法定量檢測凋亡細胞，按試劑盒提供的步驟進行操作。光鏡下觀察凋亡細胞即陽性細胞，表現(xiàn)為細胞核呈棕黃色染色，高倍鏡下(400×)每張切片隨機選取5個非重疊視野，計數(shù)每個視野的陽性細胞和細胞總數(shù)，計算陽性細胞所占百分比即凋亡指數(shù)(AI)。AI=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3 圖像分析 采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)進行圖像采集與分析，在相同光亮強度和放大倍數(shù)(10×40)條件下統(tǒng)計陽性細胞平均灰度值，平均灰度值越高，陽性表達越弱，而平均灰度值越低，陽性表達越高，每只大鼠取3張片，每張片取4個視野進行計算。

2 結(jié) 果

2.1 動物模型行為觀察 試驗前所有新生大鼠無明顯異常表現(xiàn)。造模后6 h～24 h所有新生大鼠全部存活。模型組和干預(yù)組新生大鼠開始出現(xiàn)活動減少、反應(yīng)遲鈍、翻滾等表現(xiàn)，少數(shù)發(fā)生震顫、抽搐，其間無大鼠死亡；造模后48 h～72 h模型組新生大鼠活動減少，反應(yīng)遲鈍、翻滾震顫、抽搐等行為更明顯；干預(yù)組大鼠活動減少，反應(yīng)遲鈍、翻滾等異常行為較模型組明顯減少，未見抽搐發(fā)生。

2.2 腦組織病理改變 模型組大鼠腦組織輕度水腫出現(xiàn)于6 h，明顯水腫及程度不同的萎縮出現(xiàn)于24 h，72 h可見液化壞死。干預(yù)組大鼠各時間點腦組織損傷程度與模型組比較明顯減輕，72 h未見明顯萎縮、液化及壞死。對照組大鼠各時間點腦組織未見明顯異常。模型組與干預(yù)組大鼠腦組織出現(xiàn)程度不同的神經(jīng)細胞水腫、變性、壞死、膠質(zhì)細胞增生，病灶中心出現(xiàn)核的固縮和碎裂；干預(yù)組較模型組程度明顯減輕，對照組各時間點腦組織未見明顯異常。

2.3 Bcl-2的表達情況 造模后6 h模型組與干預(yù)組Bcl-2表達開始增多，24 h表達明顯增加，48 h達到高峰，之后 Bcl-2表達逐漸下降，于造模后72 h時仍明顯高于對照組；與模型組相比，干預(yù)組各時間點Bcl-2 表達均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，模型組與干預(yù)組各時間點Bcl-2表達均顯著增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組各時間點腦組織未見或僅有少量Bcl-2表達。詳見表1、圖1。

表1 3組不同時間腦組織Bcl-2表達的變化(陽性細胞平均灰度值，±s)

圖1 免疫組化檢測Bcl-2表達(400×)

2.4 神經(jīng)細胞凋亡情況 模型組與干預(yù)組大鼠于造模后6 h，腦組織出現(xiàn)凋亡細胞，隨后凋亡細胞逐漸增多，造模后24 h～48 h其表達進一步增多，造模后72 h達到高峰。與模型組比較，干預(yù)組各時間點腦組織的凋亡細胞明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組各時間點腦組織未見或僅有少量凋亡細胞。詳見表2、圖2。

表2 3組不同時間神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)(±s)

圖2 Tunel法定量檢測凋亡細胞(400×)

3 討 論

高膽紅素血癥是新生兒期臨床常見疾病，趙捷等[5]報道其發(fā)病率為37.6%。Slusher等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在足月及接近足月的新生兒中，高膽紅素血癥的發(fā)病率約為25/10萬。高膽紅素血癥對新生兒影響較大，嚴(yán)重者可因并發(fā)膽紅素腦病造成不可逆腦損傷，并遺留多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，甚至可造成新生兒死亡，給社會和家庭帶來沉重負擔(dān)。因此，闡明新生兒高膽紅素血癥腦損傷發(fā)病機制，為臨床診治新生兒高膽紅素血癥提供理論依據(jù)具有重要意義。

近年來，國內(nèi)外針對新生兒高膽紅素血癥做了較多研究，但引起腦損傷的確切機制仍不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，高膽紅素血癥時，新生兒體內(nèi)過量的游離膽紅素可通過開放的血-腦脊液屏障進入并沉積于腦組織，從而引起腦細胞能量代謝障礙，產(chǎn)生活性異常的Na+-K+-ATP酶，興奮性氨基酸持續(xù)增多，細胞內(nèi)嚴(yán)重Ca2+超載[7]。進一步導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)及神經(jīng)細胞膜的功能被損壞，最終導(dǎo)致腦損傷的發(fā)生。

細胞凋亡(apoptosis)又稱為“程序性細胞死亡”(programmed cell death)，是細胞一種生理性、主動性的“自覺自殺行為”，是機體在生長、發(fā)育和受到外來刺激時清除多余、衰老和受損傷的細胞以保持機體內(nèi)環(huán)境平衡和維持正常生理活動過程的一種自我調(diào)節(jié)機制，但凋亡同樣也可以在病理情況下發(fā)生。有研究認(rèn)為，新生兒高膽紅素血癥與腦細胞凋亡密切相關(guān)[8]。Pazar等[9]研究發(fā)現(xiàn)新生兒高膽紅素血癥時腦細胞凋亡明顯增多。但是新生兒高膽紅素血癥腦損傷時是否有腦細胞凋亡參與，其具體機制目前仍沒有定論。目前認(rèn)為細胞凋亡的啟動存在兩條通路：內(nèi)源性凋亡通路(以線粒體介導(dǎo))和外源性凋亡通路(死亡受體介導(dǎo))。在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路中，線粒體功能異常導(dǎo)致細胞色素C(CytC)釋放，進而激活Caspase激酶系統(tǒng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2蛋白是內(nèi)源性凋亡通路中的一種重要蛋白，是抑制細胞凋亡的代表。一般認(rèn)為， Bcl-2僅在肯定能存活的神經(jīng)元上表達增高，主要分布在線粒體外膜表面，通過保護其完整性，阻斷Bax蛋白活性，阻止活化因子如CytC的釋放，從而切斷凋亡信號的傳播，進而減輕細胞損傷[10]。

神經(jīng)節(jié)苷脂是一類含有唾液酸的膜糖脂的總稱，由E·Klenk于1935年首先發(fā)現(xiàn)，在腦灰白質(zhì)中含量很多，并將這類糖脂命名為神經(jīng)節(jié)苷脂。目前已知糖部分是由己糖、氨基糖、唾液酸組成的腦神經(jīng)節(jié)苷脂有8種以上，近年來研究較多的是GM1[11]。既往研究表明，GM1可通過多種機制來對抗各種原因所致的腦組織損傷[12-14]：對抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用。GM1有別于競爭性或非競爭性NMDA受體拮抗劑，只選擇性地阻滯NMDA受體的病理性興奮，而不影響該受體對興奮性氨基酸正常生理反應(yīng)的信號傳遞；②防止細胞內(nèi)Ca2+積聚，減輕腦水腫；③維持神經(jīng)細胞膜Na+-K+-ATP酶的活性，減少神經(jīng)細胞膜脂肪酸丟失，防止ATP動力學(xué)特性改變；④增加缺血腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性，提高缺氧缺血腦組織對氧自由基的清除能力；⑤通過抑制腦細胞的自噬作用，減輕腦損傷。GM1易于通過血腦屏障，在細胞分化和發(fā)育、神經(jīng)元修復(fù)和再生等方面起重要作用。目前GM1臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療。但GM1是否對新生兒高膽紅素血癥腦損傷具有治療作用，其具體機制目前仍不十分清楚。

本實驗結(jié)果顯示，模型組與干預(yù)組均于造模后6 h Bcl-2表達開始增多，48 h達到高峰，于造模后72 h時仍明顯高于對照組；與模型組比較，干預(yù)組各時間點Bcl-2表達均增加；與對照組比較，模型組與干預(yù)組各時間點Bcl-2表達均顯著增多；對照組各時間點腦組織未表達或僅有少量Bcl-2表達。實驗結(jié)果顯示，模型組與干預(yù)組大鼠于造模后6 h腦組織出現(xiàn)凋亡細胞，隨后凋亡細胞逐漸增多，于造模后72 h達到高峰；對照組各個時間點未見明顯凋亡細胞。且大體標(biāo)本及HE染色均顯示，干預(yù)組較模型組腦損傷明顯減輕。針對實驗結(jié)果分析認(rèn)為，腦細胞凋亡參與了高膽紅素血癥腦損傷的進程，且高膽紅素血癥時Bcl-2在一定程度上影響了腦細胞凋亡的發(fā)生。提示GM1在高膽紅素血癥腦損傷時發(fā)揮了腦保護作用，其可能機制為通過促進抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，進而減少腦細胞凋亡，從而發(fā)揮其腦保護作用。

綜上所述，腦細胞凋亡參與了高膽紅素血癥腦損傷的進程，其機制與抑凋亡蛋白Bcl-2有關(guān)；高膽紅素血癥時GM1有腦保護作用，其機制可能為通過促進抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，進而減少腦細胞凋亡，最終減輕腦損傷。