推拿改善T2DM大鼠糖脂代謝性炎性損傷的分子機(jī)制研究

王 康 孟鳳仙 鈕 妍 薛恬玨 國(guó) 生 沈 潛 魏培棟 付國(guó)兵

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京，100078； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京，100029； 3 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活水平的提高，2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后另一個(gè)嚴(yán)重危害人民健康的慢性非傳染性疾病。我國(guó)糖尿病的患病率近年來(lái)呈快速上升趨勢(shì)，成人糖尿病患病率達(dá)11.6%，糖尿病前期患病率更高達(dá)50.1%[1]。既往普遍認(rèn)為，IR和胰島β細(xì)胞功能衰竭是T2DM的2個(gè)主要發(fā)病機(jī)制，但隨著近年來(lái)研究的不斷深入，相繼發(fā)現(xiàn)糖脂毒性、慢性炎性反應(yīng)、微循環(huán)功能異常及胰島β細(xì)胞去分化等因素也與T2DM的發(fā)病關(guān)系密切[2]。其中改善糖脂毒性并控制其引起的慢性炎性損傷已成為T(mén)2DM的臨床治療的核心[3]。因此，骨骼肌AMPKα2以其對(duì)糖脂代謝及炎性反應(yīng)的強(qiáng)大調(diào)控能力成為了近年來(lái)學(xué)術(shù)界研究的熱門(mén)靶點(diǎn)，AMPKα2的激活不僅可通過(guò)調(diào)控GluT4、ACC1/2等分子改善機(jī)體糖脂代謝，還可抑制NF-κB信號(hào)途徑介導(dǎo)機(jī)體的慢性炎性反應(yīng)，從而緩解糖脂毒性對(duì)機(jī)體的損傷[4]。

近年來(lái)，推拿已廣泛應(yīng)用于T2DM的臨床治療，且隨著大量臨床研究的開(kāi)展，已基本明確了推拿的臨床療效，但對(duì)于手法作用機(jī)制的研究當(dāng)前仍處于起步階段，本團(tuán)隊(duì)在前期研究中已發(fā)現(xiàn)推拿可通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/Glut4信號(hào)鏈改善T2DM大鼠的糖代謝水平[5]。因此，本次研究繼續(xù)對(duì)推拿在抑制T2DM慢性炎性反應(yīng)中發(fā)揮的手法效應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了分子層面的深入探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 4周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體重(100±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 藥物 Streptozotocin(SIGMA，美國(guó)，S0130-100)，鹽酸二甲雙胍(源葉生物，1105-70-4)

1.1.3 試劑及儀器 超純RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物)，HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(康為世紀(jì)生物)，SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(KAPA Biosystems，美國(guó))，AMPKα2抗體(Abcam，英國(guó)，ab3760)、NF-κBp65抗體(Abcam，英國(guó)，ab16502)，大鼠IL-6 Elisa試劑盒(Multisciences)。全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3,Thermo，美國(guó))，熒光定量PCR儀(ABI7500，美國(guó))，凝膠成像儀(Tanon-6600，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由進(jìn)食和飲水。1周后隨機(jī)取出6只作為空白組，其余34只給予高脂飼料(70%普通飼料、10%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供)喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，按30 mg/kg一次性腹腔注射1%濃度STZ?？瞻讓?duì)照組腹腔注射相同劑量檸檬酸緩沖液。3 d后，以空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L，視為造模成功。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、推拿組、西藥組及西藥推拿組。剔除造模失敗及干預(yù)中死亡的大鼠，最終各組取材大鼠分別為6只。

1.2.2 干預(yù)方法 空白對(duì)照組(Control Group，CON)：相同飼養(yǎng)條件下不做任何處理，但在其他組進(jìn)行干預(yù)時(shí)，給予相同的鼠袋固定15 min，固定后給予1 mL蒸餾水灌胃，1次/d，共8周。疾病模型組(Model Group，MOD)：干預(yù)方法同空白對(duì)照組。西藥觀察組(Drug Group，MET)：將配置好的二甲雙胍水溶液，按照250 mg/(kg·d)灌胃給藥，并在灌胃給藥結(jié)束后用相同鼠袋進(jìn)行固定，1次/d，共干預(yù)8周。推拿觀察組(Tuina Group，TNA)：將大鼠用鼠袋套住頭及胸部(黑暗環(huán)境有利于實(shí)驗(yàn)大鼠狀態(tài)平靜，治療依從性高)，然后給予推拿干預(yù)。具體操作如下：以神闕為中心順時(shí)針揉腹5 min，三指振腹法于小鼠關(guān)元、神闕、天樞區(qū)域施術(shù)5 min，頻率(240±10)次/min，行彈撥法于大鼠雙側(cè)梁丘血海5 min，頻率(120±10)次/min。整套手法共計(jì)15 min，手法結(jié)束后給予1 mL蒸餾水灌胃，1次/d，共干預(yù)8周。西藥推拿組(Combined Group，MIX)：首先給予推拿組相同的手法干預(yù)，然后給予西藥組相同標(biāo)準(zhǔn)的二甲雙胍灌胃，1次/d，共干預(yù)8周。

1.2.3 組織標(biāo)本采集及處理 大鼠在末次干預(yù)結(jié)束當(dāng)天晚上9點(diǎn)，禁食不禁水12 h后，依次按0.7 mL/kg的劑量腹腔注射5%的水合氯醛腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血后處死，冰浴下(4 ℃冰盤(pán))，取腹直肌并快速去除多余脂肪和結(jié)締組織后，放入凍存管內(nèi)，投入液氮保存，處死動(dòng)物。隨后將動(dòng)物組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)與方法 1)RT-PCR方法檢測(cè)AMPKα2、NF-κB及IL-6的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平Trizol法提取大鼠腹直肌總RNA，取1 μg繼續(xù)反轉(zhuǎn)錄程序，得到cDNA溶液，存于-20 ℃?zhèn)溆?。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1，以cDNA做模板，應(yīng)用real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，采用熔解曲線(xiàn)分析方法，首先對(duì)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)，待擴(kuò)增循環(huán)完成后，依據(jù)熔解曲線(xiàn)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，以確定產(chǎn)物純度。采用相對(duì)定量法，以GAPDH作為內(nèi)參基因，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。

2)Western Blot測(cè)定AMPKα2及NF-κB蛋白表達(dá)水平取各組大鼠腹直肌組織，加入RIPA裂解液，徹底混勻。冰上孵育20 min后，13 000 r/min(4 ℃)離心20 min。取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，抗體孵育，ECL顯色，膠片曝光。最后，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)western blot蛋白雜交條帶進(jìn)行掃描，并用Imagesystem 4.00軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。相對(duì)含量的變化=目的蛋白灰度/GAPDH。

表1 各引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

3)ELISA測(cè)定IL-6含量取各組大鼠腹直肌組織，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)T2DM大鼠FBG水平的影響 干預(yù)前，模型組、西藥組、推拿組、西藥推拿組與空白組比較，F(xiàn)BG值顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；西藥組、推拿組、西藥推拿組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，西藥組FBG值在第2、4、8周時(shí)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，推拿組FBG在第4、8周時(shí)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，西藥推拿組FBG在第2、4、8周時(shí)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與西藥組比較，西藥推拿組在第4周時(shí)對(duì)FBG調(diào)節(jié)效應(yīng)更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與推拿組比較，西藥推拿組在第4、8周時(shí)對(duì)FBG調(diào)節(jié)效應(yīng)更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與0周時(shí)比較，各觀察組在第2、4、8周時(shí)，均可顯著降低FBG，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.2 對(duì)T2DM大鼠腹直肌AMPKα2、NF-κB、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組AMPKα2mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥組、推拿組、西藥推拿組AMPKα2mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與西藥組及推拿組比較，西藥推拿組的AMPKα2基因轉(zhuǎn)錄有升高趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

表2 各組大鼠不同時(shí)段空腹血糖值

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，△△P<0.01；與西藥組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與推拿組比較，□P<0.05；與0周比較，■P<0.05，■■P<0.05

圖1 各組不同時(shí)期FPG水平比較

組別AMPKα2mRNA轉(zhuǎn)錄蛋白表達(dá)空白組1.10±0.090.62±0.03模型組0.62±0.13*0.31±0.01*西藥組0.78±0.10△0.46±0.02△推拿組0.71±0.05△0.50±0.07△藥推組0.90±0.10△0.50±0.06△

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，△△P<0.01

圖2 推拿對(duì)各組腹直肌組織AMPKα2mRNA轉(zhuǎn)錄(A)、蛋白表達(dá)(B)及電泳結(jié)果(C)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

表4 各組大鼠腹直肌NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，△△P<0.01

圖3 推拿對(duì)各組腹直肌組織中NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄(A)、蛋白表達(dá)(B)及電泳結(jié)果(C)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

與空白組比較，模型組NF-κBmRNA轉(zhuǎn)錄顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥組NF-κBmRNA轉(zhuǎn)錄下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，推拿組NF-κBmRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥推拿組NF-κBmRNA轉(zhuǎn)錄顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與西藥組及推拿組比較，西藥推拿組NF-κBmRNA轉(zhuǎn)錄有下降趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4、圖3。

與空白組比較，模型組IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，西藥組、推拿組及西藥推拿組IL-6基因轉(zhuǎn)錄均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，蛋白表達(dá)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；西藥推拿組較其他兩觀察組對(duì)IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng)更為顯著。見(jiàn)表5、圖4。

表5 各組大鼠腹部脂肪IL-6基因轉(zhuǎn)錄水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.01，△△P<0.01

圖4 推拿對(duì)各組腹部脂肪組織IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，脾在體合肌肉、主四肢，因此，我國(guó)歷代醫(yī)家尤其重視推拿與導(dǎo)引在“脾失健運(yùn)”相關(guān)疾病中的防治作用，本次研究中運(yùn)用到的核心手法——振腹法主要作用為培元固本，補(bǔ)益肝腎；輔以揉摩天樞以調(diào)暢氣機(jī)，溝通上下；點(diǎn)按梁丘、血海以健脾清胃，化痰降濁。近年來(lái)，推拿治療的疾病譜逐漸由原先的骨傷類(lèi)疾病向內(nèi)科慢病的方向回歸，在我國(guó)T2DM的防治領(lǐng)域推拿有著廣闊的應(yīng)用前景。然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)于推拿改善T2DM的生物學(xué)機(jī)制研究尚處于起步階段，急需相應(yīng)的基礎(chǔ)研究為推拿的臨床應(yīng)用提供現(xiàn)代科學(xué)的理論依據(jù)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎性反應(yīng)參與了整個(gè)T2DM的發(fā)病過(guò)程，其程度與IR及β細(xì)胞損傷呈正相關(guān)。糖毒性不僅可直接引起外周組織慢性炎性反應(yīng)，還可通過(guò)糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products，AGEs)、UPR、己糖胺途徑(Hexosamine Pathway)、胰臟淀粉酶沉積、β細(xì)胞去分化等途徑間接引發(fā)組織慢性炎性反應(yīng)[6]。而脂質(zhì)的異位沉積引發(fā)的脂毒性，可招募炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)OS、ERS及線(xiàn)粒體功能障礙等病理?yè)p傷也被認(rèn)為是機(jī)體慢性炎性反應(yīng)引起IR及T2DM發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[7]。

NF-κB作為與免疫調(diào)控、介導(dǎo)炎性反應(yīng)密切相關(guān)的核因子，廣泛分布于真核生物細(xì)胞中，細(xì)胞在靜息狀態(tài)下NF-κB的p50/p65亞基與抑制蛋白IκB以三具體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到TNF-α、IL-1β、IL-6及FFA等細(xì)胞因子或信號(hào)分子刺激后，與其抑制因子IκB解離，繼而進(jìn)入細(xì)胞核與相應(yīng)靶基因結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。在復(fù)雜的炎性反應(yīng)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，NF-κB的活化或是其中的一個(gè)中心環(huán)節(jié)，調(diào)控著大量細(xì)胞因子之間的相互作用[8]。

當(dāng)前，圍繞推拿的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制方面的研究正呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。有研究發(fā)現(xiàn)按摩可顯著提高小鼠的胸腺及脾臟的T淋巴細(xì)胞數(shù)量，并認(rèn)為其可作為免疫缺陷相關(guān)疾病的輔助治療方法[9]。亦有學(xué)者在治療肥胖型2型糖尿病的臨床研究中，發(fā)現(xiàn)推拿聯(lián)合藥物治療可進(jìn)一步改善血清炎性反應(yīng)因子IL-6、TNF-α及CRP水平，使炎性反應(yīng)水平得到控制[10-11]。本研究從基因與蛋白的層面均反映出了推拿對(duì)骨骼肌AMPKα2、NF-κB及IL-6的調(diào)節(jié)作用，且其對(duì)IL-6蛋白的抑制作用可在與二甲雙胍聯(lián)用后進(jìn)一步加強(qiáng)。盡管有研究[12]表明二甲雙胍可通過(guò)肝臟AMPK途徑抑制IKKα和IKKβ表達(dá)，調(diào)節(jié)相關(guān)炎性反應(yīng)因子，但在本研究中，二甲雙胍對(duì)骨骼肌NF-κB蛋白表達(dá)的抑制作用并不顯著。而推拿干預(yù)對(duì)骨骼肌NF-κBmRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)有顯著的抑制作用，且在2種干預(yù)方式聯(lián)用的情況下仍存在這一效應(yīng)。AMPK作為細(xì)胞能量代謝的“開(kāi)關(guān)”，不僅能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝，在抑制炎性反應(yīng)中同樣扮演重要角色[13]。而推拿抗炎效應(yīng)的產(chǎn)生是否由AMPKα2信號(hào)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；如果存在相關(guān)性，則推拿很有可能通過(guò)AMPKα2的下游分子SIRT1而對(duì)NF-κB合成產(chǎn)生抑制效應(yīng)[14-15]?？傊?，當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為解釋推拿在大量T2DM臨床研究[16-18]中體現(xiàn)出的抗炎效應(yīng)機(jī)制提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

此外，從對(duì)FBG的調(diào)節(jié)程度來(lái)看，與單純西藥或推拿組比較，西藥聯(lián)合推拿組在整個(gè)干預(yù)周期內(nèi)體現(xiàn)了更穩(wěn)定的血糖調(diào)控效應(yīng)。推拿組自身對(duì)照顯示降糖效應(yīng)在4周時(shí)效果最好，在第8周時(shí)血糖值再次升高，這一現(xiàn)象或與老鼠的整體狀況隨病情進(jìn)展而惡化有關(guān)，提示了推拿的獨(dú)立降糖能力有限，或更適用于輕、中度T2DM患者的臨床治療。但與模型組的比較仍可以看出，其改善機(jī)體炎性反應(yīng)，減緩T2DM病情進(jìn)展的作用是可以肯定的。

然而，本次研究仍存在一定的不足之處，如僅對(duì)AMPKα2與NF-κB的總蛋白表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，在后續(xù)研究中應(yīng)補(bǔ)充對(duì)其磷酸化蛋白水平的測(cè)定，以便于進(jìn)一步明確推拿手法對(duì)這2個(gè)信號(hào)分子的活性是否存在調(diào)節(jié)作用。此外，Irisin[19-20]、LP、ADP、Chemerin[21-22]等肌肉及脂肪因子均存在對(duì)AMPKα2與NF-κB的上游調(diào)節(jié)作用，對(duì)這些因子的篩選，也將有利于完善推拿改善T2DM代謝性炎性損傷機(jī)制的科學(xué)假說(shuō)。

綜上所述，本研究初步揭示了推拿可改善T2DM大鼠的FBG水平，增強(qiáng)骨骼肌AMPKα2基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，同時(shí)降低骨骼肌炎性因子NF-κB及IL-6的基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，其與二甲雙胍聯(lián)用可體現(xiàn)較好的協(xié)同降糖與抗炎效應(yīng)。但NF-κB、IL-6與AMPKα2三者間的關(guān)聯(lián)性，仍有待進(jìn)一步探索。