果樹根部土壤中乳酸菌群的分離和生理生化特征研究

張 蓓 王擁軍

（焦作大學(xué)化工與環(huán)境工程學(xué)院，河南焦作454003）

在果樹根部的土壤中，有各種各樣的有益的微生物，例如光合細(xì)菌、乳酸菌、酵母、放線菌等等。這些微生物能夠使果樹根部更加健康、強(qiáng)壯，有的微生物能增加果樹的產(chǎn)量、提高水果的質(zhì)量。特別是乳酸菌，產(chǎn)生的乳酸有很強(qiáng)的殺菌能力。而且，它還能把一些難分解的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成易分解的、容易被植物根部吸收的營養(yǎng)物質(zhì)。盡管乳酸菌對果樹的生長起到很多有益的作用，然而，從土壤資源中分離乳酸菌的研究很少。

眾所周知，乳酸菌的生長需要豐富的營養(yǎng)，糖類、礦物質(zhì)、氮化合物和其他的一些物質(zhì)是乳酸菌生長所必須的。然而，同其他環(huán)境條件相比，土壤中的營養(yǎng)是比較少的。但是由于水果中含有大量的糖分，所以我們就考慮由于跌落的果子，果樹根部的土壤中，乳酸菌生長所必須的營養(yǎng)成分應(yīng)該比其他土壤環(huán)境豐富。

本研究旨在對河南省部分地區(qū)果樹根部土壤中的乳酸菌進(jìn)行分離，并對分離到的乳酸菌進(jìn)行生理生化研究。

1.材料和方法

1.1 土壤樣品

從河南省不同的果樹根部（柿樹、桃樹、葡萄樹、草莓、石榴樹、棗樹、核桃樹、櫻桃樹、無花果樹、杏樹）收集到12個土壤樣品，收集時(shí)間是2017年9月份。樣品收集后裝進(jìn)無菌的袋子里，-20℃保存待分析。

1.2 菌株的分離與保存

將10g樣品加入到90ml無菌水中，用震蕩器震蕩60s，使其充分混合，然后將其用無菌水從10-1～10-5梯度稀釋， 取 10-1，10-3和 10-5倍稀釋液各10μL分別涂布于含有MRS肉湯瓊脂、Blue Light Broth瓊脂、Potato Dextrose瓊脂、Nutrient瓊脂的培養(yǎng)基；取10-1和10-2倍稀釋液各 1ml，在70℃水浴鍋中加熱20分鐘后，取 10μL涂布于Nutrient瓊脂培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)。其中，MRS肉湯瓊脂培養(yǎng)基在厭氧箱30°C厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，其他培養(yǎng)基均在好氣恒溫培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)48小時(shí)。對所有培養(yǎng)基上的菌落用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。乳酸菌的計(jì)數(shù)在MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行，大腸桿菌的計(jì)數(shù)在BLB培養(yǎng)基上進(jìn)行、霉菌和酵母通過觀察菌落形態(tài)，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行區(qū)分后分別計(jì)數(shù)。芽孢桿菌和好氧性細(xì)菌在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行計(jì)數(shù)。乳酸菌依據(jù)菌落的大小、形態(tài)和顏色，挑取單菌落并純化2次后-80℃保存于1mL加10%二甲基亞砜（DMSO）的Nutrient肉湯培養(yǎng)基中。

1.3 菌株生理生化特征分析

對分離的乳酸菌進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、革蘭氏染色。乳酸菌鹽耐受性的測定分別在含有3.0%和 6.5%（w/v）NaCl的液體 MRS培養(yǎng)基（pH6.5）中進(jìn)行，30℃下培養(yǎng)48小時(shí)后和未接種的對照管對比，記錄結(jié)果。分別在pH為3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0,9.0的液體 MRS培養(yǎng)基（pH6.5）中測試乳酸菌在不同pH下的生長情況，30℃下培養(yǎng)7天，與未接種的對照管對比，觀察記錄結(jié)果。在液體MRS培養(yǎng)基（pH6.5）中測試乳酸菌分離株在不同溫度范圍內(nèi)的生長情況，分別在 5℃，10℃，45℃，50℃條件下培養(yǎng)，其中45℃和 50℃下培養(yǎng) 7天，5℃，10℃培養(yǎng)14天，與未接種的對照管對比，觀察記錄結(jié)果。

2.結(jié)果

2.1 微生物計(jì)數(shù)

土壤中可見微生物的數(shù)量見表1?？偟膩碚f，這12個土壤樣品中乳酸菌的數(shù)量在105～106之間，好氧性細(xì)菌的數(shù)量在106～107之間,霉菌的數(shù)量在 0～106之間，酵母的數(shù)量在 105～108之間，芽孢桿菌在 104～108之間。

表1 樣品微生物分析

9 5.5×105 1.0×105 5.5×105 1.0×105 1.05×106 10 3.0×105 1.5×106 2.4×106 5.5×105 1.6×106 11 1.0×105 1.0×105 4.4×106 - 2.75×106 12 4.0×105 2.0×105 1.05×106 2.0×105 9.0×105

2.2 生理生化特征

按照生理生化特點(diǎn)，選出了部分代表菌株，其生理生化特征見表2。菌株都是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的球菌。他們都能夠在pH 3.0～9.0,10°C和40°C,3.0%和 6.5%的 NaCl條件下生存。菌株GS1-1,GS1-2,GS6-4,GS17-2,GS19-1,GS19-2,GS20-2,GS20-5不能在50°C下生長。所有的菌株在5°C條件下不生長或者長勢比較弱。

表2 代表菌株生理生化特征

3.討論

本研究中分離到的乳酸菌都為球菌，這點(diǎn)很值得注意，這可能和果樹根部土壤獨(dú)特的自然環(huán)境有關(guān)。在12個樣品中，除樣品11外，都不同程度地檢測到乳酸菌、芽孢桿菌、好氧性細(xì)菌、霉菌、酵母，說明了果樹根部微生物菌群的多樣性。