作物輪作對(duì)谷田土壤理化性質(zhì)及谷子根際土壤細(xì)菌群落的影響

牛倩云，韓彥莎，徐麗霞，張艾英，儀慧蘭*，郭二虎*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所，山西 長(zhǎng)治 046000）

谷子是我國(guó)北方地區(qū)的主栽作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位，但由于耕地有限、種植模式不合理的影響，導(dǎo)致連作障礙普遍發(fā)生。連作障礙是指在同一塊土壤中連續(xù)種植同種作物，導(dǎo)致作物長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降等現(xiàn)象[1]。研究表明，發(fā)生連作障礙的原因主要有以下幾點(diǎn)：土壤養(yǎng)分失衡；土壤pH值降低；土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，有害微生物增加[2-3]。輪作是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的一種種植制度，合理輪作能夠平衡土壤養(yǎng)分，改變土壤理化性質(zhì)，增加作物產(chǎn)量，有效避免或減少連作障礙的發(fā)生。

土壤酶參與土壤養(yǎng)分的固定和釋放，以及各種氧化還原反應(yīng)，其活性是評(píng)價(jià)土壤肥力的重要參數(shù)之一[4]。土壤微生物主導(dǎo)土壤生態(tài)系統(tǒng)中的養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)，對(duì)于維持系統(tǒng)穩(wěn)定性和可持續(xù)性有重要意義[5]。研究表明，輪作不僅有助于提高土壤酶活性，對(duì)土壤微生物組成和結(jié)構(gòu)多樣性也有明顯促進(jìn)作用。李銳等[6]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期棉花連作使農(nóng)田土壤酶活性下降，微生物多樣性降低，而輪作可提高土壤過(guò)氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和蔗糖酶活性以及微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性；于高波等[7]報(bào)道小麥、毛苕子與黃瓜輪作明顯改善了根際細(xì)菌組成，且土壤CAT、PPO和脲酶活性顯著升高；王勁松等[8]研究表明高粱-苜蓿輪作能增加土壤蔗糖酶活性和微生物多樣性。

迄今為止，關(guān)于輪作能改善土壤質(zhì)量、緩解連作障礙的報(bào)道很多[6-9]，但谷子作為山西省優(yōu)勢(shì)特色雜糧作物，具有耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是否可以建立某種輪作模式避免連年種植帶來(lái)的不利影響，尚待研究。因此，本研究設(shè)置谷子連作、馬鈴薯-玉米-谷子輪作、玉米-大豆-谷子輪作和大豆-馬鈴薯-谷子輪作4個(gè)處理，監(jiān)測(cè)不同種植模式下土壤養(yǎng)分和酶活性變化特征，并利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)谷子根際土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，明確不同種植模式對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的影響，為谷田種植模式優(yōu)化和農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

試驗(yàn)在山西省長(zhǎng)治市山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所的谷子試驗(yàn)田進(jìn)行（113°06′E，36°11′N），試驗(yàn)地所在區(qū)域日平均氣溫28℃，夜平均氣溫18℃。供試土壤為淺黏綿壚土，含堿解氮27.56 mg·kg-1、有效磷 15.01 mg·kg-1、速效鉀 93.30 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì) 15.43 g·kg-1，pH 7.14。

試驗(yàn)開(kāi)展前該田塊為谷子連作土壤，于2012年開(kāi)始輪作試驗(yàn)，選用的4種輪作作物分別是：谷子（Se?taria italica，Si）、玉米（Zea mays，Zm）、馬鈴薯（Sola?num tuberosum，St）和大豆（Glycine max，Gm）。共設(shè)四種不同種植模式：谷子連作（Si-Si-Si）、馬鈴薯-玉米-谷子輪作（St-Zm-Si）、玉米-大豆-谷子輪作（Zm-Gm-Si）和大豆-馬鈴薯-谷子輪作（Gm-St-Si），具體試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。每種種植模式3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)面積為30 m2，株間距35 cm，每公頃留苗30萬(wàn)株。2012—2015年各小區(qū)管理施肥相同，施肥水平均為氮肥（N）150 kg·hm-2、磷肥（P2O5）150 kg·hm-2、鉀肥（K2O）30 kg·hm-2，播種前將40%氮肥和全部磷肥、鉀肥作為基肥施入，其余氮肥于谷子拔節(jié)期追肥，谷子追肥時(shí)給同期田間種植的馬鈴薯、玉米和大豆施用等量氮肥。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of experiment

1.2 土樣采集及指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 土樣采集

于2014年谷子拔節(jié)期，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的5棵植株，挖取植株根周5 cm范圍內(nèi)的全部根系，用手輕抖植株根系，去除附著土，用軟毛刷刷取根部的根際土，過(guò)20目篩后裝于自封袋，-80℃保存，用作土壤微生物多樣性檢測(cè)。同期，隨機(jī)選各小區(qū)3個(gè)點(diǎn)，采集0～20 cm的耕層土壤，去除雜物，過(guò)20目篩后裝于自封袋，4℃保存，用作土壤基本理化性質(zhì)和酶活性測(cè)定。

1.2.2 土壤pH和養(yǎng)分測(cè)定

土壤pH測(cè)定采用電位法。土壤養(yǎng)分測(cè)定參照魯如坤[10]的方法，采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮含量，鉬銻抗比色法測(cè)定土壤有效磷含量，火焰光度法測(cè)定土壤速效鉀含量，重鉻酸鉀法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)。

1.2.3 土壤酶活性測(cè)定

土壤酶活性檢測(cè)參照關(guān)松蔭[11]的方法。過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，以20 min后1 g土壤消耗1 mL 0.02 mol·L-1高錳酸鉀所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（mg·g-1，F(xiàn)W）；多酚氧化酶（PPO）活性采用鄰苯三酚法測(cè)定，以2 h后1 g土壤中產(chǎn)生1 mg紫色沒(méi)食子素所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（mg·g-1，F(xiàn)W）；纖維素酶活性采用硝基水楊酸比色法測(cè)定，以72 h、1 g土壤中產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（mg·g-1，F(xiàn)W）；蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定，以24 h、1 g土壤中產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（mg·g-1，F(xiàn)W）。

1.2.4 產(chǎn)量測(cè)定

2014年谷子成熟時(shí)按小區(qū)實(shí)收記產(chǎn)，然后折算成公頃產(chǎn)量。

1.2.5 土壤微生物多樣性檢測(cè)

使用OMEGA公司生產(chǎn)的E.Z.N.A Soil DNA試劑盒，按照試劑盒的使用說(shuō)明提取和純化土壤微生物基因組DNA。將純化后的基因組DNA作為PCR模板，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V4區(qū)，使用的引物是520 F：5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′；802R：5′-TAC?NVGGGTATCTAATCC-3′。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，目的條帶用Qiagen公司生產(chǎn)的QIA?quick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒切膠回收?；厥盏腄NA送上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，去除引物序列、低于150 bp的序列和低質(zhì)量的序列；只保留重疊超過(guò)10 bp且沒(méi)有錯(cuò)配的序列。在0.97相似度下利用QIIME軟件對(duì)操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）進(jìn)行聚類分析，并制作維恩圖；基于樣品的OTU數(shù)量進(jìn)行Alpha多樣性分析，計(jì)算 Chao、Ace、Shannon 指數(shù)[12-14]；在門和屬水平上對(duì)樣品OTU進(jìn)行聚類，對(duì)聚類后各樣品所含的不同OTU序列做柱狀圖和熱圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)Duncan方法對(duì)不同處理組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤pH和土壤養(yǎng)分

在三種輪作模式下，土壤pH值和堿解氮、有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)的含量均發(fā)生改變（圖1）。與連作相比，pH值在三個(gè)輪作處理中均升高（圖1A）；堿解氮含量Gm-St-Si顯著升高，St-Zm-Si、Zm-Gm-Si無(wú)顯著改變（圖1B）；有效磷含量Gm-St-Si中最高，Zm-Gm-Si差異不顯著，St-Zm-Si降低（圖1C）；速效鉀含量在Gm-St-Si和Zm-Gm-Si中均升高，其中Gm-St-Si最高，增幅34.4%，St-Zm-Si差異不顯著（圖1D）；有機(jī)質(zhì)含量三個(gè)輪作處理均顯著升高（圖1E）。

2.2 土壤酶活性

酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，輪作會(huì)影響土壤CAT、PPO、纖維素酶和蔗糖酶活性。CAT活性在輪作處理中顯著提高，但三個(gè)輪作處理間未表現(xiàn)顯著差異（圖2A）；PPO活性在St-Zm-Si和Gm-St-Si中最高，Zm-Gm-Si次之，連作最低（圖2B）；纖維素酶活性呈現(xiàn)Gm-St-Si＞Zm-Gm-Si＞St-Zm-Si＞Si-Si-Si的趨勢(shì)，其中Gm-St-Si是連作的3.25倍（圖2C）；蔗糖酶活性在Gm-St-Si、Zm-Gm-Si和 St-Zm-Si中顯著升高，分別比連作高29.48%、13.23%和8.91%（圖2D）。綜上表明，與谷子連作相比，輪作后各土壤酶活性均處于較高水平，其中Gm-St-Si輪作的效果最顯著。

2.3 谷子產(chǎn)量

統(tǒng)計(jì)四種種植模式下谷子的產(chǎn)量，結(jié)果顯示，輪作處理的谷子產(chǎn)量均高于連作，但只有Gm-St-Si達(dá)到顯著水平，較連作高37.11%，Zm-Gm-Si和St-Zm-Si比連作高31.08%和27.52%（圖3）。

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.4.1 OTU聚類分析

在相似度0.97的水平上對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行聚類，共得到8750個(gè)OTU。如圖4所示，Si-Si-Si、St-Zm-Si、Zm-Gm-Si和Gm-St-Si組的OTU數(shù)分別為4519、4692、4970個(gè)和5745個(gè)，具體排序?yàn)镚m-St-Si＞Zm-Gm-Si＞St-Zm-Si＞Si-Si-Si，三個(gè)輪作處理的OTU數(shù)均高于連作，Gm-St-Si處理最高，為連作的1.27倍。

2.4.2 Alpha多樣性分析

圖1 四種種植模式下的土壤pH（A）和堿解氮（B）、有效磷（C）、速效鉀（D）、有機(jī)質(zhì)（E）含量Figure 1 Soil pH（A）and the contents of alkaline hydrolysis nitrogen（B），available phosphorus（C），potassium（D），and organic matter（E）under four cropping systems

本研究考察的Alpha多樣性指標(biāo)包括豐富度指數(shù)（Chao、Ace）和多樣性指數(shù)（Shannon）（表2）。Chao值在 Gm-St-Si中最高，St-Zm-Si、Zm-Gm-Si與連作間無(wú)顯著差異。與連作相比，Ace值在Gm-St-Si和Zm-Gm-Si中顯著增加，St-Zm-Si差異不顯著；Shan?non值在Gm-St-Si中顯著升高，Zm-Gm-Si中顯著下降，St-Zm-Si差異不顯著。與谷子連作比較，Gm-St-Si的Chao值、Ace值和Shannon值均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。

2.4.3 門水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

檢出的細(xì)菌主要包括8個(gè)門，Verrucomicrobia（疣微菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Planctomycetes（浮霉菌門）、Gemmatimonade?tes（芽單胞菌門）和Chloroflexi（綠彎菌門），四種種植模式下根際土壤細(xì)菌各門類的豐度有明顯差異（圖5）。與連作相比，三個(gè)輪作處理含有更豐富的疣微菌門、酸桿菌門和浮霉菌門。其中，疣微菌門在Zm-Gm-Si和Gm-St-Si中較豐富，酸桿菌門在Gm-St-Si中含量較多，浮霉菌門在Gm-St-Si中豐度最高。

2.4.4 屬水平上的細(xì)菌組成聚類分析

圖2 四種種植模式下的土壤酶活性Figure 2 Soil enzyme activities under four cropping systems

圖3 2014年谷子產(chǎn)量Figure 3 Yield of millet in 2014

圖4 四種種植模式下土壤OTU分布維恩圖Figure 4 Venn diagram showing the distribution of OTU of soil samples under four cropping systems

表2 四種種植模式下根際土壤細(xì)菌群落的Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha-diversity index of rhizosphere bacterial community under four cropping systems

在屬的水平上對(duì)樣品所含菌屬進(jìn)行聚類，分析其細(xì)菌組成的相似性和多樣性。由圖6可知，不同作物輪作后土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中Si-Si-Si和St-Zm-Si聚為一支，都含有豐富的厚壁菌門和放線菌門，Zm-Gm-Si和Gm-St-Si聚為一支，以變形菌門和浮霉菌門為主。與連作相比，三個(gè)輪作處理的Planctomyces、Gemmata、Flavisolibacter、Luteolibacter菌群豐度增加，Gm-St-Si處理增加的幅度最大，其中Planctomyces豐度比連作提高了1.16倍，Gemmata豐度提高了1.14倍，F(xiàn)lavisolibacter豐度是連作的1.87倍，Lu?teolibacter豐度是連作的3.89倍；而Flavobacterium、Lu?teimonas菌群豐度在Gm-St-Si中降低（圖7）。

3 討論

圖5 基于門水平的細(xì)菌組成分布圖Figure 5 Bacteria community distribution based on the level of phylum

適當(dāng)?shù)妮喿鞣绞侥芨纳仆寥览砘誀睿行П苊馔寥浪峄?，還能均衡土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素，平衡養(yǎng)分含量[1-2]。本研究結(jié)果表明，輪作后土壤有機(jī)質(zhì)含量和pH值均有所升高，土壤肥力增加，土壤微生物多樣性提高，有利于作物的生長(zhǎng)發(fā)育和增產(chǎn)。在種植大豆的輪作組中，土壤堿解氮含量顯著增加，可能與豆類作物的固氮作用有關(guān)，大豆能固定空氣中的無(wú)機(jī)氮，增加土壤氮含量[15]；而在St-Zm-Si處理中，土壤有效磷含量較低，可能是前茬種植玉米對(duì)磷肥消耗較多所致。前人研究報(bào)道，前茬種植玉米會(huì)導(dǎo)致農(nóng)田磷含量下降[16]，我們的結(jié)果與此一致。

土壤理化性狀和酶活性是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)，兩者共同作用推動(dòng)土壤代謝過(guò)程，影響作物生長(zhǎng)，土壤酶來(lái)源于植物根系分泌物和土壤微生物，易受土壤環(huán)境因子的影響[4]。輪作為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)提供了較高的植物多樣性，使土壤微生物多樣性增加，并提高土壤酶活性。前人研究表明，土壤中CAT、PPO活性與植株抗病性呈正相關(guān)；纖維素酶和蔗糖酶是碳循環(huán)中的關(guān)鍵酶，對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)利用有重要意義[6]。本研究結(jié)果顯示，輪作使土壤CAT、PPO、纖維素酶和蔗糖酶活性升高，有利于增強(qiáng)植株抗病性和對(duì)土壤養(yǎng)分的利用。

圖6 基于屬水平的細(xì)菌組成聚類分析Figure 6 Cluster analysis of bacteria community based on the level of genus

圖7 基于屬水平的細(xì)菌相對(duì)豐度Figure 7 Relative abundance of the dominant genus

土壤微生物參與土壤多種重要的生物化學(xué)過(guò)程，其群落的結(jié)構(gòu)及組成直接影響土壤微生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和平衡，進(jìn)而影響作物正常生長(zhǎng)發(fā)育。土壤微生物主要由細(xì)菌、真菌和放線菌組成，其中細(xì)菌是數(shù)量最多的一個(gè)類群，參與有機(jī)質(zhì)分解、氨化反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程[8]。在土壤中，根際微生物與植物根系分泌物之間的相互作用是一個(gè)重要的過(guò)程，根系通過(guò)分泌多種化合物，對(duì)根際微生物發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，進(jìn)而對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[5]。輪作作為一種常見(jiàn)的農(nóng)業(yè)技術(shù)，可使幾種作物的根系分泌物、作物殘?bào)w在土壤中積累，豐富了土壤微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)根際微生物群落的多樣性。在本研究中發(fā)現(xiàn)三種輪作模式下谷子根際微生物多樣性提高，與前人結(jié)果一致。

谷子根際土壤細(xì)菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，輪作處理的細(xì)菌數(shù)目和多樣性指數(shù)明顯高于連作，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成亦明顯不同。輪作處理中疣微菌門、酸桿菌門和浮霉菌門含量明顯升高。有研究表明，疣微菌門和酸桿菌門能有效分解有機(jī)物、提高植株抗逆能力[17]；浮霉菌門在植物營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，特別是碳源、氮源的利用方面具有重要作用[18]。另外，輪作使部分功能菌的 數(shù) 量 增 加 ，如 Planctomyces、Gemmata、Flavisoli?bacter、Luteolibacter等。Planctomyces可將多糖分解為小分子糖類被植物利用[19]；Gemmata能增加脲酶的活性[20]，脲酶是一種酰胺酶，可酶促分解有機(jī)物，脲酶活性升高能提高植物對(duì)有機(jī)物的利用率；Flavisoli?bacter能促進(jìn)土壤磷素循環(huán)[21]；Luteolibacter參與植物對(duì)有機(jī)質(zhì)的分解利用過(guò)程，對(duì)環(huán)境中碳循環(huán)有重要意義，還可能對(duì)某些植物真菌性病害有拮抗作用[22]。此外，F(xiàn)lavobacterium、Luteimonas含量在輪作組中明顯減少，而Flavobacterium可能和一些植物病害的發(fā)生有關(guān)，其豐度與谷子黑穗病的發(fā)病率呈正相關(guān)[23]，且在發(fā)病小麥的根際土壤中富集[24]。綜上表明，輪作使谷子根際土壤中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有益菌的數(shù)量明顯增加，有害菌的數(shù)量減少，對(duì)于促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)成分吸收、提高有機(jī)質(zhì)利用率、增強(qiáng)植株抗病性有重要意義，也是谷子增產(chǎn)的有利條件。

4 結(jié)論

幾種不同的輪作方式對(duì)土壤理化性質(zhì)、酶活性和根際細(xì)菌多樣性等均產(chǎn)生影響，其中大豆-馬鈴薯-谷子輪作后谷子根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)最高，土壤中富含 Planctomyces、Gemmata、Flavisolibacter、Luteoli?bacter等有益功能菌，具有更高的土壤養(yǎng)分和土壤酶活性，獲得較高谷子產(chǎn)量。綜上表明，利用大豆-馬鈴薯-谷子輪作有助于改善谷田生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)土壤肥力，促進(jìn)谷子增產(chǎn)。