糞源環(huán)丙沙星對(duì)潮土中抗生素抗性基因的影響

常旭卉，賈書剛，王淑平*，周志強(qiáng)

（1.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049；2.廣西師范學(xué)院，北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001）

抗生素在保障人類健康、促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展等方面起重要作用。我國(guó)畜禽養(yǎng)殖較為發(fā)達(dá)，經(jīng)預(yù)測(cè)，到2020年每年畜禽糞便的產(chǎn)量將達(dá)到42.4億t[3]，畜禽糞便農(nóng)用造成的抗生素和抗生素抗性基因（Antibi?otic resistance genes，AGRS）的污染問(wèn)題已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。世界衛(wèi)生組織（WHO）早在2000年的報(bào)告中就將抗生素抗藥性列為本世紀(jì)人類在健康領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)之一[5]。

畜禽養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期使用獸用抗生素以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、預(yù)防和治療動(dòng)物疾病等，但約25%～75%的抗生素未被機(jī)體吸收而隨糞尿排出體外進(jìn)入環(huán)境[8]。抗生素殘留會(huì)誘導(dǎo)土壤中ARGs的產(chǎn)生和積累[9-11]。飼料中的抗生素會(huì)顯著改變腸道中的微生物群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道中含有抗生素抗性基因的微生物顯著增加[13]。進(jìn)一步的研究表明，動(dòng)物腸道內(nèi)的抗性細(xì)菌隨著糞便排出體外后，其攜帶的抗生素抗性遺傳信息可以借助于整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等可移動(dòng)遺傳單元（Mobile genetic elements，MGEs），通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移（Horizon?tal gene transfer，HGT）機(jī)制轉(zhuǎn)移到環(huán)境微生物中，最終通過(guò)直接接觸或生物富集給人類健康帶來(lái)巨大的威脅[5，11，14-19]。

已有研究表明，家養(yǎng)雞較養(yǎng)殖場(chǎng)雞的腸道菌群更具多樣性，且抗生素抗性基因在養(yǎng)殖場(chǎng)雞的腸道菌群中分布更廣泛[13]，說(shuō)明動(dòng)物腸道中含有豐富的耐藥菌和抗性基因，腸道內(nèi)的ARGs隨糞尿排出體外，造成畜禽糞便中ARGs的檢出?，F(xiàn)有許多學(xué)者在畜禽糞便中檢測(cè)出大量ARGs，如鄒威等[22]對(duì)華北地區(qū)天津市和河北省不同類型、不同規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)糞便進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素抗性基因、磺胺類抗性基因、大環(huán)內(nèi)酯抗性基因的檢出頻率達(dá)到100%，其他的抗生素抗性基因檢出頻率基本都在80%以上。ARGs隨畜禽糞便進(jìn)入土壤環(huán)境，同時(shí)畜禽糞便中殘留的抗生素，也會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)ARGs產(chǎn)生，造成土壤中ARGs的檢出。研究表明，在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)及周邊土壤檢出大量的抗性基因，李錦等[24]發(fā)現(xiàn)在遼寧地區(qū)畜禽糞便和周邊土壤中，磺胺類和四環(huán)素類抗性基因均普遍存在，其中磺胺類抗性基因sulⅠ和sulⅡ在兩種介質(zhì)中檢出率均為100%。同時(shí)，也有研究表明畜禽糞便作為有機(jī)肥農(nóng)用不僅會(huì)增加農(nóng)田系統(tǒng)中抗性基因的豐度，并通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)糞肥施用也會(huì)增加土壤中抗生素抗性基因的多樣性[10，14，25-28]。

目前整合子（Integron）在廣泛的環(huán)境介質(zhì)中被頻繁檢出，其中I類整合子在各類環(huán)境中最為常見(jiàn)，攜帶的抗藥基因盒目前發(fā)現(xiàn)100種以上[19，29]，也有研究表明整合子與ISCR（Insertion sequence common re?gions）耦合可以進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移[5，30-31]。Dang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，海河沉積物中Ⅰ類整合子intⅠ與磺胺類基因sulⅠ的相對(duì)豐度之間存在顯著相關(guān)性，并證實(shí)sulⅠ在環(huán)境中的水平傳播與intⅠ的介導(dǎo)有關(guān)。趙祥等[35]通過(guò)對(duì)山東4個(gè)地區(qū)長(zhǎng)期使用糞肥的9個(gè)典型設(shè)施菜地土壤中的ARGs和MGEs進(jìn)行檢測(cè)和相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)可移動(dòng)元件總量intⅠ與磺胺類抗性基因及大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因呈現(xiàn)極顯著相關(guān)。ARGs可借助MGEs進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，ARGs不僅影響了土壤環(huán)境，還會(huì)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品甚至人類健康造成危害。

白洋淀區(qū)域畜禽養(yǎng)殖業(yè)十分發(fā)達(dá)，按照原國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局發(fā)布的[2004]43號(hào)文件提供的系數(shù)測(cè)算，鴨糞年排放量達(dá)21.33萬(wàn)t[37]。我國(guó)每年生產(chǎn)的氟喹諾酮類抗生素（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）有一半是用于畜禽養(yǎng)殖。Zhao等[39]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)畜禽糞便中環(huán)丙沙星、恩諾沙星的含量每千克達(dá)到幾十微克。Li等[41]對(duì)白洋淀區(qū)域河流及底泥中的氟喹諾酮類等22種抗生素進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)底泥中氟喹諾酮類抗生素含量達(dá)到65.5～1166 μg·kg-1。

針對(duì)以上情況，本研究選擇環(huán)丙沙星作為研究對(duì)象，借助室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，采用基因擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)81 d土壤中的ARGs和MGEs的濃度，并進(jìn)一步對(duì)ARGs、MGEs與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，探究糞源環(huán)丙沙星對(duì)潮土中ARGs的影響，以期為科學(xué)評(píng)價(jià)氟喹諾酮類抗生素的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和糞肥安全合理施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤為潮土，在土壤系統(tǒng)分類中為干潤(rùn)雛形土（The ustic cambosols）。2012年7月采自河北省某地?zé)o污染表層（0～20 cm）土壤，土壤有機(jī)質(zhì)27.1 g·kg-1，堿解氮 103 mg·kg-1，有效磷 3.26 mg·kg-1，pH 值7.99，土壤中無(wú)環(huán)丙沙星檢出。

1.2 土壤處理與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采集新鮮土樣過(guò)2 mm（10目）篩，充分混勻后放置于人工氣候箱中25℃恒溫培養(yǎng)一周，使土壤中微生物活化。然后取土裝盆（培養(yǎng)盆規(guī)格為頂部直徑12.0 cm×底部直徑8.5 cm×高10.0 cm），每盆裝350 g鮮土，其中含鴨糞的處理則按干土4%比例添加；調(diào)節(jié)每個(gè)培養(yǎng)盆中土壤含水率至田間最大持水量70%左右，置于人工氣候箱中25℃非密閉培養(yǎng)，并模擬實(shí)際光照周期變化（晝夜各12 h），每日通過(guò)稱重法補(bǔ)充因蒸發(fā)損失的水分，以保持恒定的土壤含水量。

試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，分別為Ⅰ：CK（對(duì)照）；Ⅱ：CIP（外源添加CIP）；Ⅲ：DF（添加不含CIP的鴨糞）；Ⅳ：DF+CIP（在Ⅲ的基礎(chǔ)上外源添加CIP）；Ⅴ：DF（CIP）（糞源CIP）。其中，含CIP的3個(gè)處理中每盆CIP的初始含量保持一致，均為17.15 mg·kg-1。試驗(yàn)所使用的鴨糞從同時(shí)飼養(yǎng)的兩批鴨子獲得，一種是不含環(huán)丙沙星的鴨糞；另一種是喂含環(huán)丙沙星的飼料所得到的鴨糞。試驗(yàn)選取培養(yǎng)81 d的土樣進(jìn)行檢測(cè)[43]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤DNA提取

稱取約0.500 g供試土樣，用FastDNASpin Kit for Soil（MP Biomedicals，USA）試劑盒，按照生產(chǎn)商提供的方法提取土壤總DNA，再用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳驗(yàn)證。提取的土壤DNA樣品用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀（Nanodrop 2000）檢測(cè)濃度和純度，所提取的DNA樣品的A260/A280值在1.8～2.0之間，表明DNA純度較高。

1.3.2 ARGs和MGEs的PCR定性檢出

本試驗(yàn)選取共6大類抗生素27種ARGs，包括四環(huán)素類抗性基因（tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG），磺胺類抗性基因（sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ），氯喹諾酮類抗性基因（qnrA、qnrS），氨基糖苷類抗性基因[aacC2、aacC4、aadA1、aadA2、aadB、aadD、aac（3）-Ⅰa、aac（3）-Ⅱa、aph（3）-Ⅱa]，氯霉素類抗性基因（Cat1、CmlA、Flor）及β-內(nèi)酰胺類抗性基因（CTX-M、OXA、SHV、TEM）；4種MGEs，包括整合子intⅠ、intⅡ，插入序列共同區(qū)域（Insertion sequence common regions，ISCRs）orf 513 和ISCR2以及細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行了PCR檢測(cè)[15]。具體目標(biāo)基因及引物序列見(jiàn)表1，引物合成由北京新科開(kāi)源基因科技有限公司完成。

PCR（Polymerase chain reaction）反應(yīng)總體系 25 μL，包括：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，r-Tap 酶0.25 μL，模板DNA 2 μL，純水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。取5 μL擴(kuò)增后產(chǎn)物，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將目的基因的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送至美吉生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，證實(shí)與已發(fā)表相似序列的同源性在95%～100%。

1.3.3 ARGs和MGEs的q-PCR定量檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time fluores?cence quantitative PCR，q-PCR）對(duì)土壤樣品中的ARGs和MGEs的豐度進(jìn)行測(cè)定。q-PCR選用Thermo Scientific公司生產(chǎn)的Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mixture（2X），將標(biāo)準(zhǔn)品用純水按10倍進(jìn)行5～6個(gè)梯度稀釋，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置無(wú)模板陰性對(duì)照，反應(yīng)在ABI-7300儀器上進(jìn)行。反應(yīng)體系包括：SYBR Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，模板 DNA 1 μL（約 1～10 ng），純水補(bǔ)足至 25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，80℃收集熒光信號(hào)1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；PCR擴(kuò)增完后按照儀器自帶程序進(jìn)行溶解曲線繪制。定量PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)特異性。

1.3.4 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤有機(jī)質(zhì)采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法測(cè)定[47]，有效磷采用Olsen法測(cè)定[47]，堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定（LY/T 1229—1999），pH采用1∶5土水比測(cè)定。

1.4 儀器與主要試劑

本試驗(yàn)主要用到的儀器包括：人工氣候箱（寧波江南儀器廠：RXZ-430E）、凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD：Universal HoodⅡ）、電泳儀（JUNYI：JY3000+）、PCR 儀（BIO-RAD：T100TM Thermal Cy?cler）、生物安全柜（蘇潔凈化：BHC-1300ⅡA/B2）、快速核酸提取儀（MP：FastPrep-24）、超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific：Nanodrop 2000）、Real Time PCR System（ABI-7300）。主要的試劑包括：環(huán)丙沙星（Sigma公司）、Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒（MP 公司）、10×PCR Buffer（Mg+plus）、dNTP Mix?ture、r-Taq DNA Polyersss（TaKaRa公司）。

表1 基因種類及引物序列信息Table 1 Gene types and information of primer sequence

1.5 數(shù)據(jù)分析

抗生素抗性基因的拷貝數(shù)的計(jì)算：根據(jù)目的基因標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)和其擴(kuò)增的CT值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣品CT值得到土壤樣品中各目的基因的拷貝數(shù)，并以基因拷貝數(shù)/土壤質(zhì)量（g，干土）為單位進(jìn)行分析。質(zhì)粒濃度換算成每微升質(zhì)粒溶液所攜帶的絕對(duì)模板拷貝數(shù)的公式為：

copies·μL-1=［x/（a+b）×660］×10-9×6.02×1023

式中：x為質(zhì)粒濃度，ng·μL-1；a為載體長(zhǎng)度，bp；b為目的基因長(zhǎng)度，bp。生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值應(yīng)大于0.98，越接近于1，結(jié)果可信度越高；擴(kuò)增效率E=10-1/斜率-1，E的范圍應(yīng)在0.8～1.2，越接近于1越理想。

采用IBM SPSS Statistics 22對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用軟件中的偏相關(guān)分析方法進(jìn)行分析，當(dāng)P值小于0.05或0.01時(shí)，表明在95%或99%的置信區(qū)間內(nèi)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理土壤中ARGs和MGEs的檢出情況

本研究對(duì)不同處理土壤中32種基因進(jìn)行檢測(cè)，包括6大類抗生素（四環(huán)素、氟喹諾酮、磺胺、氨基糖苷、氯霉素及β-內(nèi)酰胺類）抗性基因，4種可移動(dòng)遺傳元件（整合子intⅠ、intⅡ，插入序列共同區(qū)域orf 513和ISCR2）以及細(xì)菌16S rRNA基因。對(duì)比分析以上基因在各處理中的檢出差異，結(jié)果如表2所示。在調(diào)查的32種基因中共檢出4大類6種抗性基因（tetG、sulⅠ、qn?rA、qnrS、aadA2、aadD）和1種可移動(dòng)遺傳元件（intⅠ）。各處理土壤中氟喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類的檢出率分別為2/2、1/3和1/6（檢出基因數(shù)目/檢測(cè)基因數(shù)目）；氨基糖苷類抗性基因在CK、CIP及DF處理中檢出率為1/9，在DF+CIP、DF（CIP）處理中檢出率為2/9。在所檢測(cè)的4種MGEs中僅檢出intⅠ，在各處理中的檢出率為1/4。同時(shí)各處理中均檢出16S rRNA，檢出率為1/1。

表2 不同處理土壤中ARGs、MGEs及16S rRNA的檢出種類及檢出率Table 2 Types and detection rates of ARGs,MGEs and 16S rRNA in soil of different treatments

2.2 不同處理土壤中ARGs、intⅠ和細(xì)菌的定量分析

為了進(jìn)一步研究不同處理土壤中ARGs和intⅠ的濃度特征，以及糞源環(huán)丙沙星對(duì)土壤中ARGs、intⅠ和細(xì)菌的影響，本試驗(yàn)利用q-PCR技術(shù)，選取各處理中檢測(cè)率較高的基因（根據(jù)表2的PCR檢出結(jié)果），包括四環(huán)素類抗性基因（tetG）、磺胺類抗性基因（sulⅠ）、氨基糖苷類抗性基因（aadA2）、氟喹諾酮類抗性基因（qnrA）、Ⅰ類整合子（intⅠ），對(duì)不同土壤樣品中的目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析。各目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2在0.985～0.995之間，擴(kuò)增效率E在0.88～1.01之間。圖1即為不同處理土壤中各目標(biāo)基因的絕對(duì)豐度。

2.2.1 不同處理土壤中ARGs、intⅠ和細(xì)菌的濃度特征

培養(yǎng)81 d后，土壤中不同目標(biāo)基因在不同處理中絕對(duì)濃度范圍波動(dòng)較大，在 107～1016copies·g-1之間（圖1）。各處理中氟喹諾酮類抗性基因qnrA的檢出濃度在1010～1011copies·g-1之間，與CK相比，DF、DF+CIP、DF（CIP）處理中qnrA絕對(duì)豐度均顯著增加（圖1b，P＜0.05）。在CK、CIP處理中四環(huán)素類抗性基因tetG和磺胺類抗性基因sulⅠ的檢出濃度均在109～1010copies·g-1之間（圖1c、圖1e），氨基糖苷類抗性基因 aadA2的檢出濃度在 107～109copies·g-1之間（圖1f）；在DF、DF+CIP和DF（CIP）處理中tetG檢出濃度較高（檢出濃度在1012～1014copies·g-1），其次是 sulⅠ（檢出濃度在1012～1013copies·g-1）和aadA2（檢出濃度在 1011～1012copies·g-1）；施加鴨糞的 3個(gè)處理與 CK、CIP處理相比，tetG、sulⅠ、aadA2的絕對(duì)豐度均增加3～4個(gè)數(shù)量級(jí)，且差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。在DF、DF+CIP 和 DF（CIP）處理中intⅠ的檢出濃度為1013copies·g-1左右（圖1d），16S rRNA檢出濃度在1016copies·g-1左右（圖1a），與CK、CIP處理中intⅠ的濃度（1012copies·g-1左右）和16S rRNA的濃度（1015copies·g-1左右）相比均增加1個(gè)數(shù)量級(jí)，且差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。綜合上述分析，添加鴨糞的處理均顯著增加了土壤中tetG、sulⅠ、aadA2、intⅠ和16S rRNA的絕對(duì)豐度（P＜0.05）。已有研究證明畜禽糞便作為有機(jī)肥農(nóng)用會(huì)增加土壤中抗性基因的豐度。Schimitt等[27]研究發(fā)現(xiàn)施用豬糞后土壤中磺胺類和四環(huán)素類抗性基因數(shù)量明顯增加。Zhu等[52]對(duì)飼喂抗生素的豬糞以及施用豬糞的土壤進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有63種ARGs相比對(duì)照顯著增加。黃福義等[14]利用高通量熒光測(cè)序?qū)λ就林?95個(gè)ARGs進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)未施豬糞的對(duì)照組檢出66個(gè)抗性基因，施豬糞組檢出107個(gè)抗性基因，并且約一半ARGs顯著富集，表明豬糞施入不僅會(huì)增加土壤中ARGs的豐度，也會(huì)增加土壤中ARGs的種類，并改變土壤中抗生素抗性基因多樣性。

圖1 不同處理對(duì)土壤中抗生素抗性基因、intⅠ和總細(xì)菌基因的影響Figure 1 Effects of different treatments on antibiotic resistance genes,intⅠand 16S rRNA in ustic cambosols

2.2.2 糞源環(huán)丙沙星對(duì)土壤中細(xì)菌、不同類型ARGs和intⅠ的影響

單獨(dú)施加環(huán)丙沙星對(duì)土壤中不同種類ARGs的影響不同。CIP與CK處理相比，qnrA絕對(duì)豐度顯著增加（圖1b，P＜0.05）；tetG的絕對(duì)豐度增加4.97×109copies·g-1，sulⅠ、aadA2、intⅠ和 16S rRNA的絕對(duì)豐度分別降低1.13×109、1.30×108、3.69×1011copies·g-1和9.54×1013copies·g-1，但差異均未達(dá)到顯著水平（圖1a、圖 1c、圖1d、圖1e、圖1f）；說(shuō)明培養(yǎng)81 d后，單獨(dú)施加環(huán)丙沙星會(huì)增加土壤中qnrA的絕對(duì)豐度，但對(duì)tetG、sulⅠ、aadA2、intⅠ和細(xì)菌豐度無(wú)顯著影響。

糞源環(huán)丙沙星和等量鴨糞基礎(chǔ)上外源添加環(huán)丙沙星處理對(duì)培養(yǎng)81 d土壤中細(xì)菌影響不同。經(jīng)檢測(cè)DF（CIP）和DF+CIP處理中環(huán)丙沙星的殘留量為7.68、4.09 mg·kg-1。DF（CIP）、DF+CIP與DF處理相比，16S rRNA的絕對(duì)豐度分別減少1.51×1015、0.99×1015copies·g-1，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），說(shuō)明鴨糞中殘留的環(huán)丙沙星對(duì)細(xì)菌存在抑制作用。且與DF處理相比，DF（CIP）處理對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)于DF+CIP處理。此結(jié)果與周志強(qiáng)等[55]用磷脂脂肪酸方法檢測(cè)的不同處理對(duì)土壤中細(xì)菌的變化情況一致。DF+CIP、DF（CIP）與CK相比，土壤中細(xì)菌的絕對(duì)豐度均顯著增加，主要原因?yàn)轼喖S對(duì)細(xì)菌數(shù)量的增加高于環(huán)丙沙星對(duì)細(xì)菌數(shù)量的抑制。

糞源環(huán)丙沙星和等量鴨糞基礎(chǔ)上外源添加環(huán)丙沙星處理對(duì)培養(yǎng)81 d土壤中不同種類ARGs和intⅠ的影響不同。DF（CIP）、DF+CIP與CIP處理相比，qnrA絕對(duì)豐度均顯著降低（P＜0.05），DF（CIP）、DF+CIP處理中鴨糞降低了土壤中的qnrA的豐度；與DF處理相比，DF+CIP處理土壤中qnrA絕對(duì)豐度顯著增加（P＜0.05），DF（CIP）處理中 qnrA 絕對(duì)豐度降低0.78×1010copies·g-1，但差異未達(dá)到顯著水平；即 DF（CIP）處理中殘留的環(huán)丙沙星對(duì)土壤中qnrA無(wú)顯著影響，DF+CIP處理中殘留的環(huán)丙沙星會(huì)增加土壤中qnrA的豐度（圖1b）。DF（CIP）、DF+CIP與CIP處理相比，tetG絕對(duì)豐度均顯著增加（P＜0.05），DF（CIP）、DF+CIP處理中鴨糞增加了土壤中tetG絕對(duì)豐度；DF+CIP、DF（CIP）與DF處理相比，tetG絕對(duì)豐度均顯著降低（P＜0.05），即DF（CIP）、DF+CIP處理中殘留的環(huán)丙沙星降低了土壤中tetG的絕對(duì)豐度（圖1c）。DF（CIP）、DF+CIP與CIP處理相比，sulⅠ、aadA2絕對(duì)豐度均顯著增加P＜0.05），DF（CIP）、DF+CIP處理中的鴨糞會(huì)增加土壤中sulⅠ、aadA2絕對(duì)豐度；DF+CIP與DF處理相比，sulⅠ、aadA2絕對(duì)豐度分別增加3.08×1012、0.54×1011copies·g-1，但差異未達(dá)到顯著水平；DF（CIP）與DF處理相比，sulⅠ、aadA2絕對(duì)豐度均顯著增加（P＜0.05），即DF（CIP）處理中殘留的環(huán)丙沙星會(huì)增加土壤中sulⅠ、aadA2絕對(duì)豐度（圖1e和圖1f）。DF+CIP、DF（CIP）與CIP處理相比，intⅠ絕對(duì)豐度均顯著增加（P＜0.05），DF+CIP、DF（CIP）處理中鴨糞會(huì)增加土壤中intⅠ絕對(duì)豐度；DF+CIP、DF（CIP）與DF處理相比，intⅠ絕對(duì)豐度均降低，但差異未達(dá)到顯著水平，表明CIP+DF、DF（CIP）處理中鴨糞對(duì)土壤中intⅠ絕對(duì)豐度無(wú)顯著影響（圖1d）。

綜合上述DF（CIP）和DF+CIP處理中鴨糞和殘留的環(huán)丙沙星對(duì)ARGs和intⅠ影響的分析，DF（CIP）、DF+CIP與CK處理相比，土壤中qnrA、tetG、sulⅠ、aadA2、intⅠ的絕對(duì)豐度均顯著增加，說(shuō)明在本試驗(yàn)中，培養(yǎng)81 d后DF（CIP）和DF+CIP處理均增加了土壤中qnrA、tetG、sulⅠ、aadA2、intⅠ的絕對(duì)濃度。與DF處理相比，DF（CIP）、DF+CIP處理均顯著降低了土壤中tetG的絕對(duì)豐度（P＜0.05）；DF（CIP）處理顯著增加了土壤中sulⅠ和aadA2的絕對(duì)豐度（P＜0.05）；DF+CIP處理顯著增加了土壤中qnrA的絕對(duì)豐度（P＜0.05）。

本試驗(yàn)中DF（CIP）與DF+CIP處理對(duì)土壤中同種ARGs的影響存在差異。DF（CIP）與DF+CIP處理相比，qnrA、tetG、16S rRNA的絕對(duì)豐度顯著降低（圖1a、圖1b和圖1c，P＜0.05），sulⅠ、aadA2的絕對(duì)豐度顯著增加（圖1e和圖1f，P＜0.05）。這兩個(gè)處理中ARGs豐度不同的原因可能是由于DF（CIP）給鴨子飼喂CIP后，CIP造成鴨子腸道中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的改變，排出的污染的鴨糞與外源添加CIP的鴨糞中微生物組成和結(jié)構(gòu)多樣性存在差異，施用后對(duì)土壤中ARGs產(chǎn)生不同的影響，具體還需進(jìn)一步研究分析。

CK處理中均有不同種類ARGs的檢出，其中qnrA、sulⅠ、tetG的濃度較高，檢出濃度在109～1010copies·g-1之間。這一方面是由于土壤中微生物的內(nèi)在抗性，F(xiàn)arias等[58]研究發(fā)現(xiàn)在自然環(huán)境中，即使沒(méi)有抗生素存在，ARGs也存在于微生物群落中。樓晨露[10]在不施用豬糞的土壤中也檢測(cè)到較高濃度的tetA、tetG、sulⅠ和 sulⅡ，相對(duì)豐度在 10-4～10-3之間，與 Ji等[16]研究的檢出結(jié)果一致。另一方面可能是由于外界環(huán)境污染，李娟等[59]對(duì)北京地區(qū)7個(gè)典型傳統(tǒng)的養(yǎng)豬場(chǎng)廢水、周邊土壤中氟喹諾酮類耐藥基因的污染情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從養(yǎng)豬場(chǎng)廢水和土壤中均檢出了qnrD、qepA、oqxB、qnrS和oqxA等耐藥基因。高敏等[60]研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場(chǎng)糞便是空氣中ARGs的重要來(lái)源，且養(yǎng)殖場(chǎng)舍內(nèi)濃度遠(yuǎn)高于舍外。

2.3 不同處理土壤中ARGs、intⅠ豐度與土壤理化性質(zhì)的偏相關(guān)分析

影響抗性基因的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移的因素有很多。理論上抗生素作為抗生素抗性基因的直接選擇壓力，兩者之間存在一定的相關(guān)性，但并不是唯一因素。越來(lái)越多的研究表明，其他環(huán)境因子，如重金屬、其他非對(duì)應(yīng)抗生素、pH、有機(jī)質(zhì)、可移動(dòng)遺傳元件等也都對(duì)ARGs產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)對(duì)5個(gè)處理中各目的基因絕對(duì)拷貝數(shù)與16S rRNA絕對(duì)拷貝數(shù)的比值進(jìn)行計(jì)算，得到目標(biāo)基因的相對(duì)豐度，再利用偏相關(guān)分析對(duì)土壤樣品中各類型ARGs、intⅠ的相對(duì)豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表3所示。

本試驗(yàn)中不同種類的ARGs與intⅠ的相關(guān)性不同（表3）。在固定其他變量影響的情況下，intⅠ與sulⅠ、aadA2均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與qnrA呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與tetG無(wú)相關(guān)性。Selvaraj等[61]發(fā)現(xiàn)在鏈霉素壓力下，有氧生物反應(yīng)器中intⅠ與氨基糖苷類抗性基因存在顯著相關(guān)性。趙祥等[35]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用糞肥的設(shè)施菜地土壤中可移動(dòng)元件總量intⅠ與磺胺類及大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因呈現(xiàn)極顯著相關(guān)。Shi等[62]研究表明在intⅠ的可變盒中，未檢測(cè)到任何的四環(huán)素類抗性基因，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，在土霉素壓力下，某些四環(huán)素類抗性基因可能是通過(guò)轉(zhuǎn)座子進(jìn)入到質(zhì)粒，從而進(jìn)行細(xì)菌之間的水平轉(zhuǎn)移。上述研究結(jié)果均與本研究結(jié)論一致。趙祥等[35]研究表明在長(zhǎng)期使用糞肥的9個(gè)設(shè)施菜地土壤中檢測(cè)到intⅠ和多種氟喹諾酮類抗性基因（qepA、qnrB、qnrS），分析表明intⅠ與氟喹諾酮類抗性基因無(wú)相關(guān)性，與本試驗(yàn)中qnrA與intⅠ呈負(fù)相關(guān)性的結(jié)果有區(qū)別，原因有待進(jìn)一步分析。

本試驗(yàn)中不同種類的ARGs與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性不同（表3）。在固定其他變量影響的情況下，qnrA與CIP殘留量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），sulⅠ、aadA2、tetG與CIP殘留量均無(wú)相關(guān)性；TetG與有機(jī)質(zhì)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），qnrA、sulⅠ、aadA2與有機(jī)質(zhì)均無(wú)相關(guān)性；土壤中各ARGs與有效磷、pH之間均無(wú)相關(guān)性。已有研究表明土壤中ARGs與土壤理化性質(zhì)存在相關(guān)關(guān)系。王鳳花等[63]發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素不僅與四環(huán)素類抗性基因具有相關(guān)性，與氨糖苷類、磺胺類抗生素性基因也存在相關(guān)性，此結(jié)果也與本試驗(yàn)中添加鴨糞和CIP，增加了土壤中sulⅠ、aadA2相對(duì)豐度結(jié)果類似。同時(shí)，王鳳花等[63]在含有高濃度四環(huán)素抗生素殘留的再生水澆灌后的土壤樣品中，檢測(cè)出高濃度的四環(huán)素類和磺胺類抗性基因，也檢測(cè)出intⅠ和轉(zhuǎn)座酶基因。趙祥等[35]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用糞肥的設(shè)施菜地土壤中重金屬含量與氟喹諾酮類抗性基因呈極顯著相關(guān)。樓晨露等[10]研究表明在對(duì)長(zhǎng)期定量施用豬糞的稻田土壤中四環(huán)素類與磺胺類抗生素抗性基因的相對(duì)豐度與土壤pH、有機(jī)質(zhì)、重金屬As、Cd、Cu、Zn之間存在相關(guān)性。

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)中共檢出6種抗生素抗性基因（tetG、sulⅠ、qnrA、qnrS、aadA2、aadD）和1種可移動(dòng)遺傳元件（intⅠ），不同處理土壤中檢測(cè)到的目的基因基本一致。DF（CIP）和DF+CIP處理對(duì)土壤中細(xì)菌和不同種類ARGs的影響不同。DF（CIP）、DF+CIP處理均顯著降低了土壤中16S rRNA、tet G的絕對(duì)豐度；DF（CIP）處理顯著增加了土壤中sulⅠ、aadA2的絕對(duì)豐度；DF+CIP處理顯著增加了土壤中qnrA的絕對(duì)豐度。DF（CIP）與DF+CIP處理相比，土壤中qnrA、tetG和細(xì)菌的絕對(duì)豐度顯著降低，sulⅠ和aadA2的絕對(duì)豐度顯著增加，原因有待后續(xù)研究。

（2）不同種類的ARGs與intⅠ、土壤理化性質(zhì)的偏相關(guān)性不同。土壤中intⅠ與sulⅠ、aadA2呈正相關(guān)，與qnrA呈負(fù)相關(guān)，與tetG無(wú)相關(guān)性。QnrA與CIP殘留量呈極顯著正相關(guān)，sulⅠ、aadA2、tetG與CIP殘留量均無(wú)相關(guān)性。TetG與有機(jī)質(zhì)呈極顯著正相關(guān)，qnrA、sulⅠ、aadA2與有機(jī)質(zhì)均無(wú)相關(guān)性。土壤中各種ARGs與有效磷、pH之間均無(wú)相關(guān)性。

表3 土壤中ARGs、intⅠ及土壤理化性質(zhì)的偏相關(guān)分析Table 3 The partial correlation analysis of ARGs,intⅠand soil physicochemical properties