鐵離子螯合劑抗順鉑誘導(dǎo)豚鼠耳蝸毛細(xì)胞氧化損傷及調(diào)控Caspase-3表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

孫瑤 李彥 司馬國旗? 王超 趙慧云 鄔萬新

自1969年Rosenberg首次報道應(yīng)用順鉑（DDP）治療惡性腫瘤，目前已成為治療惡性腫瘤的主要化學(xué)藥物，但隨著給藥劑量的增加，順鉑對機(jī)體的毒副作用也隨之增強(qiáng)，特別是順鉑所致耳毒性仍是影響該藥使用乃至停藥的主要因素［1］。文獻(xiàn)表明［2］，順鉑耳毒性主要機(jī)制在于耳蝸螺旋器抗氧化物質(zhì)減少、活性降低，最終損害血管紋、毛細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)氧自由基活力增加和抗氧化酶類的活性喪失是產(chǎn)生細(xì)胞損害的重要因素之一。甲磺酸去鐵胺（DFO）是一類高選擇性鐵離子螯合劑，臨床用于治療輸血所致的含鐵血黃素沉著病和地中海貧血等急、慢性鐵中毒，安全有效，可競爭性地與鐵離子形成復(fù)合物，減少氧自由基的生成［3］。本文探討DFO是否能抑制耳蝸細(xì)胞凋亡，降低順鉑耳毒性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型的制備 （1）實(shí)驗(yàn)動物：選擇60只無特定病原體級健康豚鼠（Zmu-1：DHP）（購自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SOCK（浙）2012-0052），體重 300～350g，隨機(jī)分成4組。飼養(yǎng)于嘉興市第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心無特定病原體級動物室內(nèi)飼養(yǎng)，室內(nèi)室溫（22～24℃），相對濕度45%～50%，12h晝夜節(jié)律。常規(guī)顆粒飼料并添加及白菜、胡蘿卜等輔食，養(yǎng)殖及實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守3R原則，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始用于實(shí)驗(yàn)。（2）實(shí)驗(yàn)藥品及試劑：順鉑（P4394-100MG），美國SIGMA化學(xué)試劑公司，批號：MSDS-P4394-0701634；甲磺酸去鐵胺（D6533-6G），美國SIGMA化學(xué)試劑公司，批號：MSDS-D9533-0701561；T-SOD、GSH-PX、MDA試劑盒，上海索寶生物科技有限公司；一抗：c-JUN兔多克隆抗體，上海滬峰化工有限公司，貨號：DOC-071268；JNK兔多克隆抗體，上海滬峰化工有限公司，貨號：DOC-075671；Caspase-3兔多克隆抗體，Abcam中國公司生產(chǎn)，貨號：AB00026814；二抗：HRP標(biāo)記羊抗兔抗體，上海滬峰化工有限公司，貨號：DOC-072311。（3）實(shí)驗(yàn)分組及造模方法：將60只豚鼠按照隨機(jī)字?jǐn)?shù)表法分為順鉑（DDP）組、順鉑+甲磺酸去鐵胺（DDP+DFO）、甲磺酸去鐵胺（DFO）組及空白對照組。DDP組及DDP+DFO組采用順鉑腹腔注射法對豚鼠進(jìn)行耳聾模型誘導(dǎo)，給藥劑量為4mg/kg體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)給藥5d，同時DDP+DFO組豚鼠在每日注射DDP后1h給予腹腔注射DFO 150mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥5d，空白對照組以等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。（4）動物模型分析：①順鉑血藥濃度檢測：利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICPAES）法［4］對DDP組及DDP+DFO組豚鼠全血進(jìn)行檢測，評估順鉑血藥濃度，判斷建模成功。②DFO使用安全性檢測：應(yīng)用耳聲發(fā)射儀（DPOAE）檢測DFO組及空白對照組豚鼠測試頻率分別為0.5、1、2、4、8kHz處的dB的SPL幅值，判斷甲磺酸去鐵胺使用安全性。

1.2 標(biāo)本的功能學(xué)、形態(tài)學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測 （1）DPOAE進(jìn)行功能學(xué)檢測：用藥前1d及停藥第2天檢測各組豚鼠雙耳DPOAE。豚鼠給予1%戊巴比妥30mg/kg腹腔注射麻醉，應(yīng)用耳聲發(fā)射儀（Madsen CAPELLA公司）檢測雙耳500～8000Hz的DPOAE聽力圖。測試時，清除豚鼠外耳道周圍耳毛，清除耵聹，檢查外耳道及鼓膜。豚鼠頭部固定，將特制耳塞置于外耳道口，使之與外耳道口密封。選擇初始純音f1和f2，使f2/f1=1.22，強(qiáng)度差L1-L2=10dB SPL，DPOAE幅值超過本底噪聲3dB以上為檢出標(biāo)準(zhǔn)，測試頻率f0［f0=（fl×f2）/2］分別為 0.5、l、2、4、8kHz處的 dB SPL幅值。（2）光鏡及電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測：停藥后第2天各組動物心臟灌流PBS及固定液（由2.5%戊二醛及4%多聚甲醛按1∶1配制），斷頭處死后在解剖顯微鏡下制備標(biāo)本（摘除鐙骨，刺破圓窗，挑開蝸頂）。①光鏡觀察耳蝸基底膜鋪片：將每只豚鼠的左耳聽泡再以0.5%硝酸銀灌流染色，用蒸餾水沖洗后，置于2.5%戊二醛固定液中固定4h后解剖標(biāo)本，取出各回基底膜，在光鏡下鋪片觀察。②透射電鏡觀察基底膜：將每只豚鼠的右耳聽泡在2.5%戊二醛固定液中浸泡后及時送鏡室，取出基底膜后用PBS緩沖液沖洗，四氧化鋨固定，乙醇脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，半薄切片染色定位，超薄切片醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察。（3）血清學(xué)指標(biāo)檢測：處死豚鼠前取內(nèi)眥血3ml，3000r/min離心10min，取上層血清，采用脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA、自由基清除物T-SOD及谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX測定試劑盒，按使用說明檢測各組標(biāo)本血清相關(guān)指標(biāo)活力。（4）Caspase-3蛋白表達(dá)水平檢測：處死豚鼠，取耳蝸組織，采用Westernblot法對各組豚鼠耳蝸中Caspase-3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。采用WB及IP細(xì)胞裂解液抽提外周血中總蛋白，并測定濃度，加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴5min變性，調(diào)整上樣量，使上樣總蛋白量為30μg/孔，進(jìn)行電泳。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，一抗（1∶1000），4℃孵育過夜；二抗（1∶2000），37℃孵育2h。充分洗膜后，將PVDF膜置于凝膠成像分析系統(tǒng)中，膜上加ECL工作液2ml，調(diào)整曝光時間至60s，采集圖像，并采用系統(tǒng)中自帶分析軟件測定目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值，以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值作為該樣本目的蛋白表達(dá)的相對水平進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用（±s）表示，采用隨機(jī)區(qū)組t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用四格表χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型建立 根據(jù)順鉑使用量測定順鉑標(biāo)準(zhǔn)液檢測值為（2.2±0.28）μg/ml，DDP組及DDP+DFO組豚鼠全血樣品中Pt測出值分別為（2.3±0.19）μg/ml及（2.2±0.31）μg/m，相比順鉑標(biāo)準(zhǔn)液，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.637，P=0.113），證明動物模型建模成功。

2.2 DPOAE功能學(xué)檢測 見表1。

表1 各組DPOAE的dB SPL 幅值變化［dB SPL，（±s）］

表1 各組DPOAE的dB SPL 幅值變化［dB SPL，（±s）］

注：三組間兩兩比較，*P＜0.05

組別 n 0.5kHz 1kHz 2kHz 4kHz 8kHz DFO組 15-0.061±1.23 0.127±1.13 0.5067±1.31 0.401±1.01 0.231±1.17 DDP組 15-0.124±0.97-4.443±1.34-7.34±1.03 -6.079±1.19*-9.979±1.43*DDP+DFO組 15-0.067±1.03-0.641±0.89-2.876±1.26-4.011±1.11*-5.379±0.91*對照組 15-0.058±1.08 0.124±1.21 0.547±1.19 0.394±0.81* 0.257±1.09*

2.3 光鏡及電鏡形態(tài)學(xué)檢測 （1）光鏡檢查：對照組及DFO組毛細(xì)胞形態(tài)完整，毛細(xì)胞排列整齊；DDP組毛細(xì)胞損傷嚴(yán)重，包括外毛細(xì)胞及內(nèi)毛細(xì)胞均出現(xiàn)變型（細(xì)胞腫脹）及缺失，從頂回到底回其損傷依次加重，損傷細(xì)胞數(shù)量依次增加；DDP+DFO組也有不同程度毛細(xì)胞損傷，但明顯輕于DDP組，但僅限于外毛細(xì)胞，第三排外毛細(xì)胞可見變型（細(xì)胞腫脹）及缺失，第一、二排毛細(xì)胞僅見細(xì)胞變型，未見細(xì)胞缺失，內(nèi)毛細(xì)胞未見損傷。（2）透射電鏡檢查：對照組及DFO組細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體形態(tài)完整，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻；DDP組細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)濃縮、邊集，細(xì)胞內(nèi)胞漿分布不均、空泡形成，細(xì)胞器明顯減少，胞漿與細(xì)胞器形成較多假包涵體，部分可見凋亡小體；DDP+DFO組僅出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)胞漿空泡形成，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集，未見凋亡小體，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變性明顯輕于DDP組。

2.3 各組血清學(xué)各指標(biāo)活力值 見表2。

表2 各組血清學(xué)各指標(biāo)活力值（±s）

表2 各組血清學(xué)各指標(biāo)活力值（±s）

注：三組間兩兩比較，*P＜0.05

組別 n MDA（nmol/ml） T-SOD（U/mol） GSH-PX(U)DFO組 15 3.25±0.47 187.34±6.11 591.87±57.23對照組 15 3.01±0.31 192.33±5.78* 586.31±60.21*DDP+DFO組 15 6.51±0.42 129.56±9.31* 387.49±50.31*DDP組 15 9.13±0.56 93.12±6.31* 211.98±34.21*

2.4 分子生物學(xué)檢測 外周靜脈血中，DFO組Caspase-3蛋白表達(dá)相比空白對照組稍高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.813，P=0.063）；在DDP組、DDP+DFO組及空白對照組兩兩比較中，Caspase-3蛋白表達(dá)逐漸降低，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.078，P=0.0381）。

3 討論

近年來，由于大量化學(xué)藥物和抗生素的廣泛應(yīng)用，藥物性耳聾的發(fā)生率逐年上升，可占全部耳聾的30%～40%。特別是在以鉑類制劑為主的腫瘤化療藥物，其耳毒性首先發(fā)生在耳蝸毛細(xì)胞，多表現(xiàn)雙側(cè)對稱，以高頻聽力損失開始，漸向低頻擴(kuò)展，少數(shù)人會繼續(xù)惡化，甚至全聾［5］。藥物性耳聾重在預(yù)防，國內(nèi)外相關(guān)研究表明，順鉑誘發(fā)耳蝸毛細(xì)胞氧化損傷的可能機(jī)制與其直接抑制組織抗氧化系統(tǒng)及其誘發(fā)產(chǎn)生大量自由基有關(guān)。動物實(shí)驗(yàn)表明，DFO在預(yù)防抗生素所致耳毒性方面效果顯著，考慮與其減少氧自由基產(chǎn)生，降低氧化損傷有關(guān)［6］。

本資料結(jié)果，表明DFO的使用在不影響DDP血藥濃度的基礎(chǔ)上，可改善DDP所致功能學(xué)及形態(tài)學(xué)損傷，有效保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞，減輕DDP耳毒性。有研究顯示［7］，順鉑可直接抑制組織的抗氧化系統(tǒng)，使抗氧化酶GSH-PX及 T-SOD的活性下降，催化氧自由基，使生物膜中的不飽和脂肪酸過氧化引起細(xì)胞損傷，并因此形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果，DDP組與對照組比較，T-SOD及GSH-PX活力值明顯降低，MDA活力值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時在對照組、DDP+DFO組及DDP組比較中，T-SOD及GSH-PX活力值逐漸降低，MDA活力值逐漸升高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明DFP可增加DDP豚鼠耳毒性模型中抗氧化酶的活力，降低氧自由基的催化并減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而抑制DDP豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的氧化損傷。

順鉑誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞氧化損傷后，一方面，受損細(xì)胞可釋放其細(xì)胞膜表面的細(xì)胞凋亡受體因子如CD95等，并結(jié)合細(xì)胞內(nèi)蛋白接頭FADD導(dǎo)致構(gòu)象改變，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物DISC，進(jìn)而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞凋亡［8］。另一方面，順鉑DDP抑制組織抗氧化系統(tǒng)后，自由基的催化及脂質(zhì)過氧化的損傷，可誘導(dǎo)ATF2、c-JUN等轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，促進(jìn)多種促凋亡蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡［9］。在本實(shí)驗(yàn)中，DDP組與對照組比較，凋亡因子Caspase-3的表達(dá)明顯升高，提示順鉑可能通過激活JNK/c-JUN信號通路，進(jìn)而上調(diào)Caspase-3表達(dá)水平，使其行成凋亡執(zhí)行蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)［10］，DFO可通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）并誘導(dǎo)其具有保護(hù)作用的靶基因表達(dá)，阻止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中DDP+DFO組Caspase-3的表達(dá)明顯低于DDP組，且在透射電鏡下未見凋亡小體，表明DFO有效阻止了氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，同時抑制Caspase-3活性及表達(dá)，阻斷其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路從而降低細(xì)胞凋亡率。