健脾疏肝解毒方抗酒精性肝病肝損傷作用研究*

孟愛紅 陳芝蕓 莫耘松 付克模 何蓓輝 程時(shí)峰

1 浙江省杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院 浙江 杭州 311106

2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

酒精性肝?。ˋLD）是因長期過量飲酒引起的中毒性肝臟疾病。健脾疏肝解毒方是我們臨床上治療ALD的有效中藥復(fù)方[1]。本研究建立酒精性肝病小鼠模型，以健脾疏肝解毒方進(jìn)行干預(yù)，觀察其對生化、病理以及氧化應(yīng)激的影響，為臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級健康雄性C57BL/6J小鼠50只，6～8周齡，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0005。

1.2 主要藥物與試劑：Lieber-DeCarli液體飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司提供；健脾疏肝解毒方由生黃芪、白術(shù)、澤瀉、茵陳、柴胡、川楝子、片姜黃、丹參、枳椇子、葛根、半夏組成，按5∶2∶2∶2.5∶1∶1.5∶1.5∶2.5∶2.5∶1.5∶1.5比例由浙江省中醫(yī)院中藥制劑室制成流浸膏。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、膽固醇（TC）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒均由上海申能—德賽診斷技術(shù)有限公司提供；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法：小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組共5組，每組10只。各組小鼠環(huán)境適應(yīng)3天（給予顆粒飼料），液體飼料適應(yīng)4天（給予不含乙醇的常規(guī)液體飼料）后，正常組給予不含乙醇的常規(guī)液體飼料喂養(yǎng)，其它各組以低濃度乙醇（5%）的Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)13天，在造模的同時(shí)中藥高、中、低劑量組分別灌服42.86g/kg/d、21.43g/kg/d、10.72g/kg/d的健脾疏肝解毒方流浸膏，正常組和模型組則灌服等容量的生理鹽水，連續(xù)13天。第14天早上7點(diǎn)～9點(diǎn)以高濃度乙醇（30%）液體飼料灌胃，監(jiān)測小鼠情況，9小時(shí)后，用異氟烷麻醉小鼠，眼眶取血，分離血全自動(dòng)生化儀檢測血清AST、ALT、TG、TC水平；斷頸處死小鼠后分離肝臟，部分進(jìn)行肝組織勻漿，采用考馬斯亮蘭法檢測肝組織勻漿蛋白含量，MDA采用硫代巴比妥酸檢測，GSH-PX活力采用分光光度法檢測；部分于10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組2010年制訂的《酒精性肝病診療指南》光鏡觀察肝組織脂肪變和炎癥程度等病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用mean±SD表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健脾疏肝解毒方對酒精性肝病小鼠生化的影響：模型組血清AST、ALT、TG水平較正常組明顯增高（P＜0.01），TC水平較正常組明顯降低（P＜0.01）；中藥各劑量組血清AST水平及中藥高劑量組血清ALT水平均較模型組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），中藥中、低劑量組ALT水平與模型組差異無顯著性（P＞0.05）；各治療組TG及TC水平與模型組無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 健脾疏肝解毒方對酒精性肝病小鼠肝組織的影響：光鏡下正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，模型組小鼠可見大量脂肪滴沉著，有炎細(xì)胞浸潤，部分中見小葉內(nèi)壞死灶。各治療組組織病理與模型組相似，但脂滴沉積程度有所減輕。見圖1。

2.3 健脾疏肝解毒方對酒精性肝病小鼠肝臟MDA含量、GSH-PX活力的影響：模型組小鼠肝組織勻漿MDA含量較正常組明顯增多（P＜0.01），GSH-PX活力較正常組顯著降低（P＜0.01）；中藥各劑量組小鼠肝臟MDA含量較模型組明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；中藥高、中劑量組小鼠肝組織GSH-PX較模型組明顯增高（P＜0.05），中藥低劑量組與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

表1 健脾疏肝解毒方對酒精性肝病小鼠生化的影響（±s）

表1 健脾疏肝解毒方對酒精性肝病小鼠生化的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

TG（mmol/L）0.57±0.05 1.11±0.24**1.08±0.28**1.14±0.25**1.00±0.10**分組正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組ALT（IU/L）31.11±3.52 71.89±17.22**49.81±8.99**#58.86±15.93**56.51±10.07**AST（IU/L）172.16±46.71 227.76±90.07**160.86±17.43##176.11±19.62#169.65±14.77#TC（mmol/L）4.39±0.44 3.37±0.39**3.44±0.33**3.23±0.32**3.38±0.21**

圖1 各組小鼠病理變化情況（HE×200）

表2 健脾疏肝解毒方對酒精性肝病小鼠肝臟MDA、GSH-PX的影響（±s）

表2 健脾疏肝解毒方對酒精性肝病小鼠肝臟MDA、GSH-PX的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

GSH-PX（酶活力單位/mgprot）160.42±32.33 119.29±17.97**143.91±29.91#146.46±16.29#135.49±29.02*分組正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組MDA（nmol/mgprot）170.11±0.58 4.93±0.95**3.10±0.51**##3.64±0.84**##4.22±0.65**#

3 討論

根據(jù)ALD的病因、病理及臨床特征，中醫(yī)學(xué)將其歸屬為“傷酒”“脅痛”“酒疸”“水臌”“酒癖”“酒積”等范疇。酒味苦，性辛熱，且能助濕，少量飲酒有益，過量則為害。酒的過量攝入，使?jié)?、熱、毒蘊(yùn)結(jié)體內(nèi)，損傷肝脾，致肝之疏泄和脾之運(yùn)化功能失職，肝郁脾虛，氣血不和，痰濁內(nèi)生，氣、血、痰、濕相互搏結(jié)，停于脅下，形成積塊（酒癖）。其病機(jī)可歸納為：脾胃氣虛、痰濕內(nèi)阻、水濕內(nèi)停、氣血不和、氣滯血瘀等，其中，酒傷肝脾、聚濕生痰為發(fā)病關(guān)鍵，素體稟賦不足、脾胃虛弱為發(fā)病之本[2]。我們在臨床上以健脾祛濕、疏肝理氣、化瘀解毒為治療法則，并制成健脾疏肝解毒方。方中重用生黃芪、白術(shù)益氣健脾，茵陳、澤瀉清熱利濕，柴胡、川楝子疏肝理氣，半夏燥濕化痰散結(jié)，丹參、葛根、枳椇子、片姜黃活血化瘀解毒，肝脾同治，共奏健脾疏肝解毒之功，臨床收到良好療效。

本實(shí)驗(yàn)參考Ki SH等[3]建立的酒精性肝病模型，采用低濃度乙醇液體飼料喂養(yǎng)小鼠13天后，再加1次高濃度的乙醇灌胃，模仿了人類臨床上的慢性酒精依賴患者1次醉酒后的酒精性肝炎的急性發(fā)作情況，較單純灌服Lieber-DeCarli液體飼料或酒精等更接近人類的酒精性肝炎的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)顯示，模型組小鼠肝組織有大量脂質(zhì)沉積，血清TG、ALT、AST明顯增高，提示酒精性肝病模型成功。模型組小鼠TC水平較正常組明顯降低可能與小鼠進(jìn)食酒精飼料，食欲下降導(dǎo)致的隱性營養(yǎng)不良有關(guān)。目前認(rèn)為，機(jī)體攝入酒精后可通過多種代謝途徑產(chǎn)生大量活性氧基團(tuán)（ROS）[4]，ROS可攻擊生物膜上的脂質(zhì)誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，進(jìn)一步形成MDA等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。GSH-PX是清除ROS的一種主要酶，可通過清除H2O2起到抗氧化損傷的作用而保護(hù)肝組織。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酒精性肝病模型小鼠肝組織MDA含量升高，GSH-PX活力下降。經(jīng)健脾疏肝解毒方干預(yù)后，小鼠ALT、AST水平有不同程度降低，肝組織脂肪沉積減少，同時(shí)GSH-PX活力提高，MDA水平降低，提示具有健脾祛濕、疏肝理氣、化瘀解毒作用的健脾疏肝解毒方能通過增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減少脂質(zhì)過氧化而減輕酒精引起的肝組織損傷。