基于幾何形態(tài)學(xué)對二囊亞屬三種庫蠓翅形的變化分析(雙翅目：蠓科：庫蠓屬)*

段 琛 常瓊瓊 羅 婭 周煥飛 侯曉暉

(遵義醫(yī)學(xué)院， 貴州遵義 563000)

庫蠓屬Culicoidesa隸屬于雙翅目Diptera、蠓科Ceratopogonidae，目前在全世界共發(fā)現(xiàn)1 415種庫蠓(Borkent, 2016)，我國庫蠓已知348種(Changetal., 2017)，庫蠓是一類重要的媒介昆蟲(張海林等, 2012)，能夠傳播多種疾病，如人類的奧柔普西病毒病(Robertsetal., 1981; Carpenteretal., 2013)、牲畜的藍(lán)舌病、非洲馬瘟、牛流行性出血熱、水泡性口炎等(王飛鵬等, 2012)。庫蠓的形態(tài)分類是研究蠓傳疾病的基礎(chǔ)，其分類鑒定主要是根據(jù)小眼面間柔毛有無、復(fù)眼是否分離、觸角感受器分布等特征，在亞屬到種的鑒定過程中最關(guān)鍵的特征是翅斑分布情況，如二囊亞屬中南山庫蠓C.lansangensis、長喙庫蠓C.longirostris、連斑庫蠓C.jacobsoni三種庫蠓除了具有該亞屬的共有特征外，其小眼面間均無柔毛、翅斑較為明顯、中4室及徑5室的淡斑分布也較為接近，傳統(tǒng)分類鑒定較難區(qū)分。因此，單純依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定很容易混淆。近年來，幾何形態(tài)學(xué)(Geometric morphometric)的逐漸發(fā)展與廣泛應(yīng)用，為昆蟲分類學(xué)研究提供了更多的可能性(Zelditchetal., 2012)。幾何形態(tài)學(xué)將生物形態(tài)形狀(form)、大小(size)、物理性能(physical property)等因素抽離，只留下形狀變異單因素，并通過地標(biāo)點(landmark)，將研究對象的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為笛卡爾坐標(biāo)系中的點陣，從而根據(jù)地標(biāo)點所提供的形狀信息，來實現(xiàn)對不同生物機(jī)體的種間與種內(nèi)微小結(jié)構(gòu)差異的量化分析(白明等, 2009; Mitteroeckeretal., 2009)。因此，幾何形態(tài)學(xué)在近似種的研究中有著明顯的優(yōu)勢。國內(nèi)可見李玲等(2017)運用幾何形態(tài)學(xué)對離腹寡毛實蠅屬的3種實蠅翅脈進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)3種實蠅的翅脈變異主要發(fā)生在翅端的第5徑室、第2中室，為實蠅分類提供了更多的依據(jù)。溫光華等(2015)使用幾何形態(tài)學(xué)對5種稻蝗前后翅進(jìn)行了形態(tài)變異的分析，發(fā)現(xiàn)在前翅的緣前脈域、前緣脈域和臀脈域及后翅的亞前緣脈域、前緣脈域和軛脈域的變異位點都可以作為稻蝗物種的分類特征。而庫蠓屬的幾何形態(tài)學(xué)研究在國內(nèi)卻鮮有報道。本研究通過幾何形態(tài)學(xué)來分析在我國分布的庫蠓屬二囊亞屬3種庫蠓(南山庫蠓、長喙庫蠓、連斑庫蠓)的翅脈變異情況，以期找出近似種間主要的變異部位，為庫蠓的近似種分類研究提供更有效的方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本整理及圖像獲取

本研究所用標(biāo)本為研究組館藏標(biāo)本以及外單位饋贈標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)侯曉暉和劉國平老師鑒定，具體信息見表1。本研究選取翅面完整且無褶皺的3種庫蠓玻片，共計33張，即南山庫蠓C.lansangensis11張(編號為N1～N11)、長喙庫蠓C.longirostris7張(編號為C1～C7)、連斑庫蠓C.jacobsoni15張(編號為L1～L15)。利用OLYMPUS BX43顯微鏡和DP26照相機(jī)對所有庫蠓標(biāo)本進(jìn)行拍照，并保存所有個體的翅圖。

表1 供試庫蠓相關(guān)信息Tab.1 Information of the Culicoides in this study

1.2 數(shù)據(jù)提取及標(biāo)準(zhǔn)化處理

用tpsUtil 1.6將翅形圖片格式文件轉(zhuǎn)化為TPS格式文件，然后用tpsDig2分別對3種庫蠓的翅進(jìn)行地標(biāo)點(Landmark)，所有標(biāo)點都選擇在翅脈穩(wěn)定的交叉點或轉(zhuǎn)折點，每張圖片的地標(biāo)點位置、順序一致且標(biāo)點數(shù)目相同，都為13個(圖1)，使用tpsSmall 1.2對3種庫蠓翅原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行內(nèi)部的相關(guān)性檢驗，并使用廣義普氏分析法(Generalized procrustes analysis, GPA)進(jìn)行普氏疊加(Procrustes superimposition)，排除原始坐標(biāo)值包含的非形狀因素。

圖1 翅的13個地標(biāo)點及翅脈Fig.1 Landmarks and veins on the wing of CulicoidesArc: 弓脈；M，M1，M2: 中脈，中1脈，中2脈；R: 徑脈；R-M: 徑中橫脈；r1, r2: 徑1室和徑2室；Cu, Cu1, Cu2: 肘脈，肘1脈，肘2脈。Arc: Arculus; M, M1, M2: Medial and branches; R: Radial; R-M: Radial-median crossvein; r1, r2: First and second radial; Cu, Cu1, Cu2: Cubital and branches.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)上述所取的地標(biāo)點數(shù)據(jù)，對3種庫蠓的翅進(jìn)行主成分分析(Principal components analysis，PCA)來比較種間的差異。利用薄片樣條法(Thin plate spline，TPS)來分析地標(biāo)點的差異，通過網(wǎng)格輪廓圖來展示3種庫蠓翅脈上的差異。通過典型變量分析(Canonical variate analysis, CVA)，輔以馬氏距離(Mahalanobis distance)和普氏距離(Procrustes distance)及其差異顯著性比較來展現(xiàn)其結(jié)果。此外，本研究還運用NTSYS-pc 2.10e軟件進(jìn)行聚類分析，用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)構(gòu)建聚類圖來探討3種庫蠓之間的翅脈、翅形的相似關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 三種庫蠓的形態(tài)特征比較

本研究中南山庫蠓C.lansangensis、長喙庫蠓C.longirostris和連斑庫蠓C.jacobsoni三種庫蠓利用形態(tài)學(xué)特征來區(qū)分比較困難，尤其是三者小眼面間均無柔毛、翅斑較為明顯、中4室及徑5室的淡斑分布也較為接近(表2、圖2)。

2.2 三種庫蠓翅的主成分分析

根據(jù)地標(biāo)點信息，對3種庫蠓的翅進(jìn)行主成分分析。共獲得22個主成分(Principal component，PC)，其中第1主成分(PC1)占總變異量的44.98%，第2主成分(PC2)占總變異量的18.30%，第3主成分(PC3)占總變異量的10.62%，前3個主成分的特征值占總變異量的73.89%，能夠說明3種庫蠓翅的主要差異。如圖3散點圖所示，根據(jù)3種庫蠓在PC1和PC2及PC3正負(fù)軸的分布狀況可以得出在三者之中連斑庫蠓翅的種內(nèi)變異較大，而長喙庫蠓翅的種內(nèi)變異較小。在PC1軸上，長喙庫蠓介于南山庫蠓和連斑庫蠓之間；在PC2軸上，南山庫蠓與連斑庫蠓較為接近，而長喙庫蠓距離兩者較遠(yuǎn)；在PC3軸上，三者均較為接近。因此，在PC1和PC2散點圖上可以看出3種庫蠓均能較好分開，連斑庫蠓和長喙庫蠓雖有交集，但無點的交叉，而在PC1和PC3的散點圖中，南山庫蠓與長喙庫蠓則有部分點的交集。

表2 本研究中3種庫蠓形態(tài)特征對比Tab.2 Comparison of morphological features of three Culicoides in this study

圖2 本研究中3種庫蠓的一側(cè)翅圖Fig.2 The wing of three Culicoides in this studyA. 南山庫蠓C. lansangensis；B. 長喙庫蠓C. longirostris；C. 連斑庫蠓C. jacobsoni.

結(jié)合圖3中網(wǎng)格輪廓圖的扭曲狀況可知，在PC1軸上，翅的變異主要發(fā)生在徑1室和徑2室內(nèi)(標(biāo)點4到5、6)以及中肘叉到肘1脈端部和中2脈的區(qū)域(標(biāo)點11到10、8)，表現(xiàn)為徑1室和徑2室區(qū)域呈明顯縮小趨勢，而中4室和中2室端部則整體呈外展趨勢。在PC2軸上，變異區(qū)域主要發(fā)生在徑2室到徑5室內(nèi)(標(biāo)點4到6、7)以及中肘叉到肘1脈端部的區(qū)域(標(biāo)點11到10、9)，表現(xiàn)為徑1室和徑2室向徑中橫脈方向縮小，而中4室呈現(xiàn)出外展的趨勢。在PC3軸上，翅的變異主要發(fā)生在中4室內(nèi)(標(biāo)點11到10、9)以及徑5室(標(biāo)點5、6到7)，表現(xiàn)為徑5室呈外展趨勢，而中4室向四周擴(kuò)展。因此，3種庫蠓翅的差異主要集中于徑1室、徑2室、徑5室區(qū)域以及中2室近端部、中4室內(nèi)。

2.3 三種庫蠓翅的聚類分析

用3種庫蠓翅的形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，獲得3種庫蠓翅型及翅脈的相似性關(guān)系(圖4)。在距離系數(shù)為0.07時，長喙庫蠓和南山庫蠓聚在一起，而連斑庫蠓單獨成為一支，說明南山庫蠓和長喙庫蠓翅的形態(tài)相似性較高。

2.4 三種庫蠓翅的形態(tài)變異

在主成分分析的基礎(chǔ)上，通過典型變量分析(CVA)來探討種間翅的形態(tài)變異，如圖5所示，3種庫蠓不同個體均聚在一起。針對3種庫蠓的形態(tài)變異距離進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(表3)，3種庫蠓的翅型兩兩之間均具有顯著差異(P<0.05)，且南山庫蠓與長喙庫蠓的馬氏距離僅11.6676，說明兩者的翅型差異最小，而連斑庫蠓與長喙庫蠓的馬氏距離為14.9147，說明兩者的翅型差異最大，這與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 三種庫蠓翅第1 主成分和第2、3主成分的散點圖及網(wǎng)格輪廓圖Fig.3 The scatter plots of PC1 and PC2, PC3 for wing and outline variation of three Culicoides

圖4 基于普氏距離的3種庫蠓翅形態(tài)聚類分析Fig.4 Phenetic tree of wings of 3 different Culicoides based on the Procrustes distance

表3 3種庫蠓翅普氏距離及馬氏距離的顯著性比較(基于10 000 次重復(fù))Tab.3 Shape difference of wing of three Culicoides based on the Procrustes distance/ Mahalanobis distance and significant test (based on 10 000 permutation rounds)

圖5 3種庫蠓種間翅形狀典型變量分析散點圖Fig.5 The scatter plots of Canonical variate analysis of three Culicoides

3 討論

目前，國外已有利用幾何形態(tài)學(xué)方法解決庫蠓近似種的分類問題，如Muoz-Muoz(2011)將幾何形態(tài)學(xué)與分子研究相結(jié)合對庫蠓亞屬的灰黑庫蠓種團(tuán)(Pulicarisgroup)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾何形態(tài)學(xué)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行區(qū)分，以及針對庫蠓屬二囊亞屬不顯庫蠓種團(tuán)(Obsoletusgroup)的研究發(fā)現(xiàn)丘夫庫蠓(Culicoidesdewulfi)應(yīng)該踢出此種團(tuán)，且提出同種不同地理種群的翅形差異變化并不大(Muoz-Muozetal., 2014)。鑒于上述工作，本研究針對南山庫蠓、長喙庫蠓、連斑庫蠓三種庫蠓翅的形態(tài)變化進(jìn)行幾何形態(tài)學(xué)分析研究，發(fā)現(xiàn)3種庫蠓的翅型有明顯差別，通過CVA分析、聚類分析等顯示長喙庫蠓與南山庫蠓的翅型較為接近，而連斑庫蠓與兩者的翅型差異較大。進(jìn)一步證實，幾何形態(tài)學(xué)方法在庫蠓屬近似種的分類鑒定中是十分有效的。

雖然庫蠓翅的大小也存在一定的變異，但其受環(huán)境因素影響較大，如溫度、各個時期的營養(yǎng)狀況以及幼蟲的在土壤中的密度等(Smithetal., 2003; Jirakanjanakitetal., 2007)。因此，本文主要探討了庫蠓近似種的翅形變化，根據(jù)以往研究發(fā)現(xiàn)，翅形的變化較為穩(wěn)定，且在不同種間差異較大，這可能與翅脈的變化或者基因水平的變異有一定的關(guān)系(Birdsalletal., 2010)，但其變異具體與哪些基因以及翅脈走向相關(guān)尚且不得而知，需要進(jìn)一步深入研究。

本研究中薄板樣條分析(TPS)顯示3種庫蠓的翅形變化區(qū)域主要集中在徑1室、徑2室及中4室，這為今后的分類鑒定提供更多可參考的依據(jù)，即根據(jù)這些部位的差異作為形態(tài)鑒定的補(bǔ)充。此外，在庫蠓分類研究中也可以通過尋找?guī)祗烦岬闹饕儺愇稽c，從而建立起形態(tài)分析數(shù)據(jù)庫，借助對所獲標(biāo)本地標(biāo)點數(shù)據(jù)的比對，進(jìn)行種類鑒定，為庫蠓的自動鑒定系統(tǒng)開發(fā)提供了可能。