星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化鹿角多肽酶解工藝

王平，張會(huì)敏，李剛，孫鐵鋒，秦文，劉凡杰

(1.天津大學(xué)精密測(cè)試技術(shù)及儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東大學(xué)校醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250012；4.山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250062)

鹿角膠是一種名貴中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，稱之為白膠[1]，具有補(bǔ)血、益精等功效。鹿角膠作為鹿角的主要提取物，藥用已近兩千年，《本草圖經(jīng)》記載“鹿，年歲久者，其角堅(jiān)好，煮以為膠，入藥彌佳”[2]。鹿角膠中含有豐富的蛋白質(zhì)，高達(dá)82.49%[3]，臨床療效十分顯著。但由于其蛋白質(zhì)分子量較大，嚴(yán)重降低了鹿角膠的利用率[4-5]。因此，急需提高鹿角膠的生物利用度，以便充分開發(fā)利用名貴中藥資源，更好地為人類健康服務(wù)。

由于多肽結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單，易被吸收且具低過(guò)敏性，被廣泛應(yīng)用在臨床上，并為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)。近年來(lái)，多肽的生理功能愈來(lái)愈受到重視[6-7]。鹿角多肽是從鹿角中分離得到的一類分子量在0.2～10 kDa之間的具有生物活性的多肽[8]。鹿茸、鹿角分別是梅花鹿或馬鹿鹿角的未骨化的幼角、已骨化的角或角基，是不同生長(zhǎng)期的鹿角。與大量文獻(xiàn)報(bào)道的鹿茸多肽相關(guān)研究[8-10]相比，對(duì)鹿角多肽的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見，且已有文獻(xiàn)多以水解度、多肽得率評(píng)價(jià)鹿茸多肽的制備工藝。本文在前期研究的基礎(chǔ)上[11]，以酶用量、底物濃度、溫度為自變量，多肽含量及峰面積總和為因變量進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，建立了一個(gè)可行、科學(xué)的制備方法，為鹿角多肽的深度研發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料

ZX-002紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；Waters 2965高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司)；KDM型控溫電熱套(鄄城華魯電熱儀器有限公司)；BP211D賽多利斯電子分析天平(德國(guó)SARTORIUS公司)；HHS6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；LGJ-10冷凍干燥機(jī)(盛超科創(chuàng)(北京)生物科技有限公司)；-80 ℃冰箱(美國(guó)FOMAS公司)。

鹿角膠是由鹿角片經(jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠，鹿角片(批號(hào)：150470，河北亞寶藥業(yè)有限公司)經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究室鑒定為馬鹿正品，制法和鑒別按照2015年版中國(guó)藥典“鹿角膠”[1]項(xiàng)下進(jìn)行。胃蛋白酶(批號(hào)：O1202A，美侖生物)；細(xì)胞色素C(Mr12500)、抑酞酶(Mr6500)、桿菌酶(Mr1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mr451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mr189)；結(jié)晶牛血清清蛋白(BSA，純度為98%)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)、10% NaOH溶液、無(wú)水醋酸鈉、冰乙酸、乙腈、甲醇等。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹿角多肽的制備

稱取適量的鹿角膠粉末、胃蛋白酶，置于50 mL三角瓶中，加乙酸和乙酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)至要求的pH，超聲震蕩溶解后，置于恒溫水浴鍋中，調(diào)至酶解溫度進(jìn)行酶解；酶解結(jié)束后，直接加熱至95 ℃滅活，保持5 min，8 000 r/min離心10 min，分離上清液即得鹿角多肽酶解液。

2.2 HPLC法檢測(cè)鹿角多肽含量

2.2.1 對(duì)照品配制

精密稱取細(xì)胞色素C、抑酞酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸適量，用流動(dòng)相配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的不同相對(duì)分子量的肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.2.2 樣品制備

取200 μL鹿角多肽酶解液，加純凈水稀釋至2 mL，混合均勻，用微孔濾膜過(guò)濾(0.2 ～0.5 μm聚四氟乙烯或尼龍過(guò)濾膜)，即得鹿角多肽待測(cè)樣品。

2.2.3 色譜條件

2.2.4 方法學(xué)考察

對(duì)混合對(duì)照品分別進(jìn)行了精密度(進(jìn)樣6針)、重復(fù)性(混合對(duì)照品6份)、穩(wěn)定性試驗(yàn)(0、2、4、6、12、24 h)，測(cè)定峰面積，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，說(shuō)明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

2.2.5 樣品的檢測(cè)與分析

將樣品的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)曲線中5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(細(xì)胞色素C、抑酞酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸)進(jìn)行出峰時(shí)間對(duì)比分析，見圖1。然后用GPC數(shù)據(jù)處理軟件，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進(jìn)行計(jì)算，即可得到樣品中肽的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布范圍。用峰面積歸一化法計(jì)算鹿角多肽相對(duì)峰面積百分比之和。

1 細(xì)胞色素C；2 抑酞酶；3 桿菌酶；4 乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸；5 乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸圖1 鹿角多肽HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of Antlers polypeptide

2.3 雙縮脲法測(cè)定鹿角多肽含量

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備

取標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清白蛋白(BSA，純度為98%)，用H2O 配制成10.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

2.3.2 雙縮脲試劑配制

稱取1.50 g硫酸銅(CuSO4·5H2O)和6.0 g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)，用500 mL水溶解，在攪拌下加入300 mL 10% NaOH溶液，用水稀釋到1 000 mL，配制成雙縮脲試劑。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取12支試管分兩組，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1 mL，然后加入4 mL雙縮脲試劑，充分搖勻后，在室溫(20～25 ℃)下放置30 min，于540 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.247 2x+0.016 5，R2=0.995 8。

2.3.4 樣品含量測(cè)定

取鹿角多肽酶解液適量，用同樣的方法測(cè)定，每個(gè)樣品平行3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出鹿角多肽含量。

2.4 單因素考察

2.4.1 底物濃度的影響

配置底物濃度分別為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/mL(鹿角膠粉末/溶液體積)，酶用量為2.5%，設(shè)置酶解時(shí)間為6 h，pH 3.5，酶解溫度為40 ℃，酶解。隨著底物濃度的提高，鹿角多肽峰面積在0.08 mg/mL左右達(dá)到最高，鹿角多肽含量在0.07 mg/mL左右達(dá)到最高，當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)升高時(shí)鹿角多肽峰面積、鹿角多肽含量反而下降(圖2)。

圖2 底物濃度與多肽峰面積、多肽含量關(guān)系Fig.2 Relationship between substrate concentration and polypeptide peak area and content

2.4.2 酶用量的影響

配置酶用量分別為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%(酶質(zhì)量/鹿角膠粉末質(zhì)量)，設(shè)置底物濃度為0.05 mg/mL。酶解時(shí)間為6 h，pH 3.5，酶解溫度為40 ℃，酶解。隨著酶用量的增加，鹿角多肽峰面積、鹿角多肽含量均出現(xiàn)了先增加再降低，再小幅度增加降低的過(guò)程，在1.5%左右達(dá)到最高(圖3)。

圖3 酶用量與多肽峰面積、多肽含量關(guān)系Fig.3 Relationship between enzyme dosage and polypeptide peak area and content

2.4.3 酶解溫度的影響

配置底物濃度為0.05 mg/mL，酶用量為2.5%，酶解時(shí)間6 h，pH 3.5，酶解溫度分別為30、35、40、45、50 ℃，酶解。隨著溫度的升高，鹿角多肽峰面積先增加，并在40 ℃左右達(dá)到最高，然后降低后繼續(xù)增加(見圖4)；鹿角多肽含量在45 ℃左右達(dá)到最高，然后略微降低。

圖4 溫度與多肽峰面積、多肽含量關(guān)系Fig.4 Relationship between temperature and polypeptide peak area and content

2.4.4 pH 的影響

由于胃蛋白酶在pH 5.0時(shí)失活，因此，本文選擇pH 4.5為考察的最大值。配置底物濃度為0.05 mg/mL，酶用量為2.5%，酶解時(shí)間為6 h，酶解溫度為40 ℃，pH分別為2.5、3、3.5、4、4.5，酶解。在pH 2.5～3時(shí)，鹿角多肽峰面積沒有數(shù)據(jù)；pH 4.5時(shí)，多肽面積最大；鹿角多肽含量在pH 2.5～4.5區(qū)間逐漸增大。因此選用pH 4.5為最佳pH(圖5)。

圖5 pH與多肽峰面積、多肽含量關(guān)系Fig.5 Relationship between pH and polypeptide peak area and content

2.4.5 酶解時(shí)間的影響

配置底物濃度為0.05 mg/mL，酶用量為2.5%，酶解溫度為40 ℃，pH 3.5，酶解時(shí)間分別為4、5、6、7、8 h，酶解。隨著時(shí)間的增加，多肽峰面積、鹿角多肽含量逐漸增加，7 h后增加緩慢。因此選用7 h作為酶解時(shí)間(圖6)。

圖6 時(shí)間與多肽峰面積、多肽含量關(guān)系Fig.6 Relationship between time and polypeptide peak area and content

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化制備鹿角多肽

2.5.1 因素與水平的確定

采用單因素考察法對(duì)鹿角多肽峰面積影響因素進(jìn)行初步考察，發(fā)現(xiàn)酶用量、底物濃度及溫度是最主要的影響因素。因此確定酶用量、底物濃度、溫度為考察因素，3個(gè)自變量的取值范圍為酶用量A：1.20%～4.00%，底物濃度B：0.04～0.08 mg/mL、溫度C：30～50 ℃。每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表1～2。

表1 因素水平

表2 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Arrangement and results of central composite design test

2.5.2 模型擬合

采用Design expert 8.0.5軟件對(duì)模型數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，以鹿角多肽峰面積Y1和多肽含量Y2為響應(yīng)值，分別對(duì)酶用量A、底物濃度B、溫度C，進(jìn)行多元回歸擬合后，得到二項(xiàng)式擬合方程：

Y1= -1.33×104+2.32×103A+1.44×105B+3.57×102C-8.79×103AB-1.73×101AC-5.14×102BC-1.99×102A2-

Y2=1.25×102-2.96×10-2A-5.83×102B-1.32C-8.40×101AB+2.12×10-1AC+4.32BC-1.35A2+6.44×103B2+

2.5.3 方差分析

針對(duì)Y1來(lái)講，模型F值為3.63，P=0.0285<0.05，表明該模型有顯著性差異。失擬項(xiàng)值為4.9(P=0.0530>0.05)，表明模型比較穩(wěn)定，擬合度良好。其中A、B、C對(duì)含量面積無(wú)顯著性差異(P>0.05)，AB，AC，BC交互相對(duì)含量面積均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，A2對(duì)含量面積有非常顯著性差異(P<0.01)，B2對(duì)含量面積有顯著性差異(P<0.05)，C2對(duì)含量面積有顯著性差異(P<0.05)。

針對(duì)Y2來(lái)講，模型F值為5.92，P=0.0051<0.05，表明該模型具有非常顯著性差異。失擬項(xiàng)值為0.31(P=0.886 9>0.05)，表明模型比較穩(wěn)定，擬合度良好。其中A、B對(duì)多肽含量具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)，C對(duì)多肽含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，AB，AC，BC交互相對(duì)多肽含量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，A2、B2對(duì)多肽含量有顯著性差異(P<0.05)，C2對(duì)多肽含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。詳見表3

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)方差分析

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.5.4 模型擬合

根據(jù)已確定的方程為模型，以多肽峰面積值和多肽含量為因變量，繪制效應(yīng)面的三維圖，見圖7、8。等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。結(jié)果得到最佳工藝條件：酶用量A為1.78%，底物濃度B為0.08mg/mL，溫度C為39.96 ℃。為了便于實(shí)際操作，最終確定的參數(shù)為酶用量1.8%，底物濃度0.08mg/mL，溫度40 ℃。

2.5.5 優(yōu)選工藝驗(yàn)證

按照酶用量為1.8%，底物濃度為0.08mg/mL，溫度為40 ℃，制備3份鹿角多肽酶解液。鹿角多肽含量實(shí)際平均值為82.21%，預(yù)測(cè)值為83.69%；鹿角多肽峰面積實(shí)際平均值為1 880.87，預(yù)測(cè)值為1 916.68；計(jì)算偏差分別為1.77%、1.87%，小于2%，證明所得到的擬合方程可以較好地描述工藝中各因素與評(píng)價(jià)指標(biāo)的關(guān)系，可見采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法預(yù)測(cè)得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，預(yù)測(cè)性良好。

圖7 各因素對(duì)峰面積影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of various factors affecting peak area

圖8 各因素對(duì)多肽含量影響的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of various factors affecting polypeptide content

3 討論

本文采用前期研究已建立的HPLC法，對(duì)鹿角膠酶解液進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以雙縮脲法對(duì)鹿角膠酶解液進(jìn)行多肽含量測(cè)定。由于HPLC色譜峰峰面積的大小直接反映了酶解液中鹿角多肽的相對(duì)含量，故本文選取多肽含量及峰面積總和為考察指標(biāo)(因變量)，以酶用量、底物濃度、溫度為自變量進(jìn)行評(píng)判。預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的偏差分別為1.77%、1.87%(小于2%)，表明本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便合理、穩(wěn)定，可預(yù)測(cè)性良好。因此，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法提取鹿角多肽更加科學(xué)、穩(wěn)定，為進(jìn)一步開展鹿角多肽分離、純化及新藥研發(fā)等工作提供了保障。