利用人體攜帶植物基因信息推斷居住地

劉萌妍，劉艷磊，吳平，陳慶，周世良

（1.北京市公安司法鑒定中心，北京 100192；2.中國(guó)科學(xué)院植物研究所 系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093）

無(wú)名尸體尸源信息的破解對(duì)于案件性質(zhì)的判斷有著至關(guān)重要的作用。確認(rèn)尸源信息一直是刑偵領(lǐng)域的難點(diǎn)。常用的尸源查找手段主要為“內(nèi)源性”信息技術(shù)手段，包括通過(guò)法醫(yī)人類學(xué)判斷死者體貌信息、顱像復(fù)原、Y系親緣庫(kù)比對(duì)等。隨著流動(dòng)性人口的增加，“內(nèi)源性”信息技術(shù)手段已無(wú)法完全解決尸源查找這一難點(diǎn)。

孢粉學(xué)證據(jù)作為一種“外源性”信息能夠反映一定的死者生活信息，但以往孢粉學(xué)證據(jù)基本采自無(wú)名尸體的附屬物、體表、消化系統(tǒng)和上呼吸道[1]。本研究嘗試通過(guò)提取死者肺組織中的植物遺傳信息這一“外源性”信息，利用目前數(shù)據(jù)庫(kù)信息較為豐富的植物通用matK和rbcL基因作為DNA條形碼進(jìn)行研究，根據(jù)植物所屬地推斷死者可能長(zhǎng)期生活的地區(qū)，為案件調(diào)查提供一種新的技術(shù)手段，縮小偵查范圍，提供有效偵查方向。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究樣本來(lái)源于一具無(wú)身份信息的男性尸體。尸體在北方某地被發(fā)現(xiàn)時(shí)已呈腐敗狀態(tài)，肺組織呈中度腐敗。切取雙肺各葉邊緣組織10塊，每塊質(zhì)量約為1g。由于肺組織中花粉分布不均勻，為了降低取樣偏差，本實(shí)驗(yàn)將10份樣本進(jìn)行混合后提取DNA。本研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)樣本及方法已通過(guò)北京倫理學(xué)會(huì)的審查。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與葉綠體基因擴(kuò)增

將獲得的肺組織用液氮冷凍后磨碎，采用mCTAB法（改良CTAB法）提取總DNA[2]。利用Wizard? DNA Clean-Up System（美國(guó)Promega公司）對(duì)得到的DNA進(jìn)行純化，采用專一擴(kuò)增植物葉綠體基因matK的引物（F：5′-CATTATGTTAGATATCAAGGAAA-3′；R：5′-GCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGC-3′）和rbcL的引物（F：5′-AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT-3′；R：5′-CATGTACCTGCAGTAGCATTCAAGT-3′）擴(kuò)增matK和rbcL基因片段[3-4]。

PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)采用10 μL反應(yīng)體系，包括：10×PCR緩沖液（含Mg2+）1 μL，2 mmol/L dNTP混合液1 μL，5 μmol/L 正向引物 0.5 μL，5 μmol/L 反向引物0.5 μL，2.5 U/μLTaqDNA 聚合酶 0.1 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 5.9 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在 Mastercycler pro S PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）上進(jìn)行。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳（JY04S-3D型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）檢測(cè)，觀察并拍照。膠檢時(shí)加入1μL PCR產(chǎn)物和4μL 1×溴酚藍(lán)緩沖液。利用Wizard?DNA Clean-Up System對(duì)所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物用于后續(xù)高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

1.2.2 高通量測(cè)序

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)獲得的matK和rbcL基因片段為不同物種該基因片段的混合物，常規(guī)的Sanger測(cè)序無(wú)法實(shí)現(xiàn)多樣品同一基因混合物的測(cè)序。為了測(cè)定這些基因片段，本研究采用Ion S5TM系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）高通量測(cè)序平臺(tái)?；蚱位旌衔锝?jīng)純化后，由北京泛生子基因科技有限公司利用Ion Plus Fragment Library Kit（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）標(biāo)準(zhǔn)流程[5]測(cè)序文庫(kù)并利用Ion S5TM系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3matK和rbcL基因序列獲取

在所有種子植物中，每科選取一條序列作為代表，構(gòu)建高質(zhì)量的參考數(shù)據(jù)庫(kù)matK-db和rbcL-db。使用Divide程序（https://github.com/wpwupingwp/divide），根據(jù)引物序列將Ion S5TM系統(tǒng)測(cè)序數(shù)據(jù)拆分為matK和rbcL基因數(shù)據(jù)，并以97%相似性為閾值，將各基因數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，生成多條共有序列（consensus se?quence），舍去豐度為1的序列（singleton）。使用Filter程序（https://github.com/wpwupingwp/filter），以matK-db和rbcL-db作為參考，過(guò)濾非特異性擴(kuò)增序列，得到候選序列matK-contigs和rbcL-contigs后，將其與參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行合并，使用MAFFT程序進(jìn)行多序列比對(duì)[6]。得到的比對(duì)文件，分別調(diào)用IQTREE軟件[7]，選用GTR+F+R4模型構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行1000次超速自舉（ultrafast bootstrap）檢驗(yàn)[8]。根據(jù)候選序列在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的位置、姊妹群、最近共同祖先和支長(zhǎng)以及可信度等信息，篩選得到序列rbcL-ML和matK-ML。使用Usearch程序[9]，以rbcL-ML和matK-ML為模板，從原始的Ion S5TM系統(tǒng)測(cè)序數(shù)據(jù)中調(diào)取與這些序列相似性大于97%的原始序列，使用MAFFT程序進(jìn)行全局比對(duì)，手工刪除長(zhǎng)度異常的序列及空位（gap），調(diào)用VSEARCH程序[10]，以相似性95%為閾值，生成最終的結(jié)果序列rbcL-result和matK-result。以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中nr數(shù)據(jù)集為參考進(jìn)行在線BLAST[11]比對(duì)，確定這些序列可能的科和屬。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果，將同屬物種所有的matK或rbcL基因序列下載，與核準(zhǔn)的序列合并，用MAFFT程序進(jìn)行比對(duì)，并使用BioEdit軟件（https://bioedit.software.informer.com）進(jìn)行手工校正，得到數(shù)據(jù)矩陣。將這些數(shù)據(jù)矩陣通過(guò)PAUP軟件[12]構(gòu)建最大簡(jiǎn)約樹(shù)，確定與核準(zhǔn)序列具有最近親緣關(guān)系的物種。查詢這些物種的分布區(qū)，推斷尸體可能長(zhǎng)期居住的地區(qū)。

2 結(jié) 果

2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增

從有一定程度腐敗的肺組織中成功提取到DNA（圖1A）。其中，樣品2的DNA純化前后未見(jiàn)明顯改善，但在后續(xù)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中獲得明顯擴(kuò)增條帶。純化前后DNA的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1B～C。

2.2 高通量數(shù)據(jù)

從Ion S5TM系統(tǒng)測(cè)序共獲得1957440條序列，數(shù)據(jù)量可以保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析。使用Divide數(shù)據(jù)拆分程序，共得到83 144條rbcL基因的序列，60 665條matK基因的序列。經(jīng)過(guò)聚類及Filter程序過(guò)濾后得到rbcL基因一致性序列3355條，matK基因一致性序列2721條。與參考序列合并、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)后，舍去豐度過(guò)低的數(shù)據(jù)，從死者的肺組織中得到的種子植物共計(jì)27科31屬32種，見(jiàn)表1。

圖1 DNA提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果

表1 從肺組織中檢測(cè)到的植物種類

2.3 比對(duì)結(jié)果

將上述序列與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（Na?tional Center for Biotechnology Information，NCBI）公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行初步對(duì)比分析，篩選出與中國(guó)物種關(guān)系密切的物種。

在31個(gè)屬中有9個(gè)屬的物種有一定程度的指示作用，分別是波羅蜜屬（Artocarpus）、黃連屬（Coptis）、龍眼屬（Dimocarpus）、買麻藤屬（Gnetum）、銀葉樹(shù)屬（Heritiera）、同鐘花屬（Homocodon）、鐵力木屬（Mesua）、刺葵屬（Phoenix）和青梅屬（Vatica）。

在波羅蜜屬（Artocarpus）中，經(jīng)與NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中該屬47種186條rbcL基因序列進(jìn)行初步對(duì)比分析，檢測(cè)到的序列與3個(gè)中國(guó)產(chǎn)物種關(guān)系密切。這3個(gè)種的8條代表性rbcL序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，檢測(cè)到的序列與光葉桂木（A.nitidus）聚為一支，最可能屬于光葉桂木（A.nitidus，圖2A）。

在黃連屬（Coptis）8個(gè)物種有matK基因序列，五裂黃連（C.quinquesecta）和五葉黃連（C.quinquefolia）數(shù)據(jù)缺失。經(jīng)與8個(gè)物種的12條matK序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，檢測(cè)到的序列與峨眉黃連（C.omeiensis）和三角葉黃連（C.deltoidea）聚為一支，關(guān)系最近（圖2B）。

在龍眼屬（Dimocarpus）中除了滇龍眼（D.yunna?nensis）外，其余中國(guó)產(chǎn)物種均有rbcL序列。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，檢測(cè)到的序列屬于龍眼（D.longan，圖2C）。

在買麻藤屬（Gnetum）中，經(jīng)與19種38條rbcL序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，確定檢測(cè)到的序列與中國(guó)產(chǎn)海南買麻藤（G.hainanense）、羅浮買麻藤（G.luofuense）、買麻藤（G.montanum）和小葉買麻藤（G.parvifolium）關(guān)系最密切（圖2D）。

在銀葉樹(shù)屬（Heritiera）中，所有物種均有rbcL參考序列。然而，rbcL不能有效區(qū)分這3個(gè)物種（圖2E）。

同鐘花屬（Homocodon）僅2種。

鐵力木屬（Mesua）僅1種。

刺葵屬（Phoenix）中有2個(gè)中國(guó)產(chǎn)物種有matK參考序列，但該基因沒(méi)有分辨率。

在青梅屬（Vatica）中，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，檢測(cè)到的序列與青梅（V.mangachapoi）和婆羅洲青梅（V.coriacea，馬來(lái)西亞的婆羅洲）關(guān)系密切（圖2F）。

依據(jù)《中國(guó)植物志》（http://frps.iplant.cn）對(duì)9個(gè)屬的物種進(jìn)行生長(zhǎng)地域的檢索，得到相對(duì)相關(guān)度高的地域，詳見(jiàn)表2。

圖2 從肺組織中檢測(cè)到的屬于地區(qū)特有植物的基因片段及其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表2 9個(gè)具有一定指示作用植物屬的基本情況

2.4 調(diào)查結(jié)果

經(jīng)過(guò)實(shí)地調(diào)查走訪，死者生前于廣西南部某縣長(zhǎng)期生活過(guò)。

3 討 論

肺組織長(zhǎng)期與外界環(huán)境接觸，當(dāng)花粉進(jìn)入肺泡后刺激機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而將花粉顆粒包裹、激化，隨著細(xì)胞死亡而鈣化，永久性沉積于肺組織中?；ǚ圩陨?yè)碛袃蓪踊ǚ郾冢虼司哂泻軓?qiáng)的保護(hù)遺傳物質(zhì)的能力。上述兩個(gè)條件使其遺傳物質(zhì)可以在人體內(nèi)長(zhǎng)久保存，且不易遭到破壞，甚至在腐敗組織中都可以提取到植物遺傳物質(zhì)。植物的突出特點(diǎn)之一是固著生長(zhǎng)，某些植物對(duì)環(huán)境要求高，形成了特異性地理分布區(qū)域，因此植物具有天然的地理位置指示作用。在上述理論基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行了采用人體所攜帶植物的基因信息判斷居住地的實(shí)驗(yàn)。

本研究在死者肺組織內(nèi)共取得27科31屬32種植物，31個(gè)屬中，物種數(shù)目差異很大，有超過(guò)15個(gè)屬都難以鑒定到種。

一些序列如艾（Artemisia vulgaris）、構(gòu)樹(shù)（Brous?sonetia papyrifera）、金魚(yú)藻（Ceratophyllum demersum）、西瓜（Citrullus lanatus）、桔（Citrus sinensis）、水稻（Oryza sativa）、側(cè)柏（Platycladus orientalis）、寬葉香蒲（Typha latifolia）等，雖然能鑒定到種，但由于物種分布區(qū)域廣泛，地區(qū)指示作用有限。有的植物，如大麻（Cannabis sativa）和罌粟（Papaver somniferum），流通普遍，沒(méi)有指示作用。

最終，本研究篩選出9個(gè)屬具有一定指示作用的物種，并分析這9個(gè)屬物種的分布數(shù)據(jù)，主要分布在廣東、廣西、福建、云南、海南、四川、湖南等省，其中以廣東、廣西、海南和云南特有植物出現(xiàn)率最高，提示死者生前可能在長(zhǎng)江以南流域長(zhǎng)期生活，尤其是廣東、廣西、云南、海南等地可能性更高。

調(diào)查結(jié)果顯示，死者生前確實(shí)于廣西南部某縣長(zhǎng)期生活過(guò)，與分析結(jié)果相符，表明利用人體肺組織內(nèi)所攜帶植物的基因信息推斷居住地的方法可以輔助推斷死者生前的長(zhǎng)期居住地，為無(wú)名尸案件的尸源查找提供新的法醫(yī)學(xué)鑒定思路。本研究采用的是DNA條形碼技術(shù)，該技術(shù)由HEBERT等[13]提出，是利用一小段易于擴(kuò)增的DNA片段區(qū)分、鑒別生物物種的技術(shù)。不同于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別物種的方式，DNA條形碼技術(shù)更加高效、準(zhǔn)確、可重復(fù)。

DNA條形碼的選擇對(duì)于種屬鑒定也至關(guān)重要。通常評(píng)價(jià)DNA條形碼有以下幾個(gè)條件：（1）DNA片段短小且易于擴(kuò)增，尤其適用于腐敗的檢材。（2）目標(biāo)DNA片段可以作為標(biāo)準(zhǔn)在絕大多數(shù)植物分類中應(yīng)用。（3）目標(biāo)DNA片段在種間變異度大，具有種間高分辨率；在種內(nèi)變異度小，具有相對(duì)的保守性；含有系統(tǒng)進(jìn)化信息，可以顯示在分類系統(tǒng)中的位置。（4）該目標(biāo)DNA片段應(yīng)有高度保守區(qū)域以方便引物設(shè)計(jì)[14]。

本研究選擇了rbcL和matK這兩個(gè)DNA條形碼組合提取植物DNA。rbcL和matK是第三屆國(guó)際DNA條形碼會(huì)議上被推薦作為植物DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼的核心標(biāo)記，具備以下幾項(xiàng)優(yōu)勢(shì)[15]：（1）rbcL和matK均是葉綠體基因組的蛋白編碼基因，在PCR擴(kuò)增時(shí)可以直接篩選出植物基因，避免人類、真菌等其他非植物真核生物的基因干擾。（2）本研究所用rbcL長(zhǎng)度為402bp，matK長(zhǎng)度為349bp，片段短小，即使是降解檢材亦可擴(kuò)增。（3）rbcL的屬內(nèi)變異小，相對(duì)保守，可以很好地顯示在屬水平的系統(tǒng)進(jìn)化位置；matK在葉綠體基因組中具有較快的進(jìn)化速率，因此具有一定的種間差異，具備相對(duì)較高的種間分辨率。（4）由于rbcL和matK為植物通用條形碼，研究者應(yīng)用較多，通用引物相對(duì)完善，數(shù)據(jù)庫(kù)充足。但是這兩個(gè)DNA條形碼并不完美，對(duì)部分植物的分辨能力往往僅到科屬水平，并不能全面達(dá)到種的水平，因此未來(lái)需要開(kāi)發(fā)分辨率更高的基因標(biāo)記。

內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS），即5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列，是目前系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建中最受歡迎的一個(gè)DNA條形碼，也是中國(guó)植物條形碼協(xié)會(huì)進(jìn)一步建議補(bǔ)充的DNA條形碼。不同于葉綠體基因組，ITS屬于核基因組，且高度重復(fù)，其進(jìn)化速率比matK更快，同時(shí)具有拷貝間序列隨時(shí)間推移趨于一致的特點(diǎn)，因此其分辨率相對(duì)rbcL和matK更高，可以準(zhǔn)確追溯種間關(guān)系，即可以將大部分植物區(qū)分至種[16]。本次實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)也采用了ITS序列，但I(xiàn)TS序列在真核生物中廣泛存在，本實(shí)驗(yàn)中提取到的DNA絕大部分是人類的，會(huì)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生干擾。如何在擴(kuò)增此DNA條形碼時(shí)減少人類ITS序列的擴(kuò)增是目前正在探索的問(wèn)題。

值得注意的是，花粉的傳粉方式大致分為風(fēng)媒傳粉和蟲(chóng)媒傳粉。約87.5%的被子植物由昆蟲(chóng)傳粉[17]，這意味著蟲(chóng)媒花粉傳播范圍小，從而形成具有不同群落結(jié)構(gòu)的花粉譜。相較于風(fēng)媒花粉，蟲(chóng)媒花粉可能更具區(qū)域特異性，提示攜帶者在該區(qū)域停留時(shí)間更長(zhǎng)。風(fēng)媒傳粉和蟲(chóng)媒傳粉植物應(yīng)在未來(lái)的研究中列入數(shù)據(jù)分析參考系。

DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，純化后擴(kuò)增效果明顯提高，得到了與目的片段長(zhǎng)度相符的擴(kuò)增片段。雖然樣品2純化后未見(jiàn)DNA條帶，但PCR產(chǎn)物的電泳圖顯示獲得明顯擴(kuò)增條帶。經(jīng)后續(xù)高通量數(shù)據(jù)分析，確實(shí)發(fā)現(xiàn)植物DNA信息，證明純化后樣品2中確實(shí)有微量的植物DNA被提取出來(lái)。

在PCR的3個(gè)條帶中，較長(zhǎng)的片段可能為低等植物相應(yīng)基因片段，較短的為引物二聚體。本研究的重點(diǎn)是種子植物，這些植物的分布有非常明確的地理分布記載，所以片段長(zhǎng)度在250～500bp的部分才會(huì)被用于后續(xù)分析。

本研究提供了一種利用人體肺組織內(nèi)所攜帶植物的基因信息推斷居住地的方法，可以輔助推斷死者生前的長(zhǎng)期居住地，為無(wú)名尸案件的尸源查找提供了新的法醫(yī)學(xué)思路。本研究原本希望能夠根據(jù)植物成分含量比例推測(cè)具體的來(lái)源地域，但目前通過(guò)reads數(shù)并不能完全衡量各物種的比例關(guān)系，對(duì)植物所屬地的推斷不夠理想。若聯(lián)合其他尸源溯源手段會(huì)有效提高案件偵破率，希望未來(lái)該技術(shù)能夠成為刑事法醫(yī)學(xué)的一種常用尸源溯源手段，為案件偵破提供有效方向。