豬冷凍精液在規(guī)?；i場(chǎng)的應(yīng)用探索

陳獻(xiàn)欣，蘭 云，李暉仁，唐一波，吳細(xì)波，凌 宏，張灼源

（1．廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng)， 廣西 橫縣 530317；2．崇左市畜牧站， 廣西 崇左 532200）

人工授精技術(shù)起源于1780年意大利科學(xué)家Spallanzani，其通過(guò)對(duì)比格犬進(jìn)行人工授精并取得成功[1]。而應(yīng)用于豬的人工授精技術(shù)的探索則始于20世紀(jì)30年代。1956年，Ploge在他的《豬人工授精》一書(shū)中，描述了源于20世紀(jì)30年代前蘇聯(lián)國(guó)營(yíng)農(nóng)場(chǎng)所探索、應(yīng)用的包括采精、精液稀釋和輸精等相關(guān)的豬人工授精技術(shù)，論述豬人工授精可以使得高質(zhì)量公豬得以更廣泛的應(yīng)用，低風(fēng)險(xiǎn)、低成本地引入新的遺傳物質(zhì)，實(shí)用且不引入疾病等優(yōu)點(diǎn)[2]。但由于受限于當(dāng)時(shí)的保存、稀釋、配送網(wǎng)絡(luò)、輸精工具等條件，直到20世紀(jì)60至80年代，豬人工授精技術(shù)才得以大范圍的推廣，并在歐洲、亞洲等地迅速普及。我國(guó)豬人工授精技術(shù)于20世紀(jì)90年代開(kāi)始被廣大養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶(hù)所接受和應(yīng)用推廣。目前國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬行業(yè)采用人工授精技術(shù)對(duì)母豬進(jìn)行授精的比例，在集約化的大中型種豬場(chǎng)中這一比例超過(guò)95%。豬人工授精技術(shù)的普及，加快了優(yōu)秀公豬遺傳物質(zhì)的推廣，提高生產(chǎn)效率，取得了很高的經(jīng)濟(jì)效益。但是優(yōu)秀公豬精液的長(zhǎng)期保存、運(yùn)輸、遺傳物質(zhì)的國(guó)際間交流等問(wèn)題依然是一系列難題，阻礙養(yǎng)豬行業(yè)的快速發(fā)展。

隨著科研人員的深入研究，人工授精技術(shù)又取得新的進(jìn)展，即豬冷凍精液技術(shù)：利用干冰（-79 ℃）、液氮（-196 ℃）、液氦（-269 ℃）等作冷卻源，將精液特殊處理后冷凍，保存在超低溫的液氮（-196 ℃）狀態(tài)下，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的，并且解凍后能夠使精子達(dá)到輸精的要求。世界許多科學(xué)家在精液冷凍液配方的篩選、提高解凍后精子的活率和頂體完整率等方面進(jìn)行了較多研究，豬冷凍精液的應(yīng)用才得以在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣開(kāi)來(lái)。1976年，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧繁殖所經(jīng)過(guò)4年的努力，完成了豬冷凍精液的制作、稀釋、配種、分娩等一系列試驗(yàn)，對(duì)國(guó)內(nèi)豬冷凍精液的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[3]。

豬冷凍精液技術(shù)具有長(zhǎng)期保存精液，不受時(shí)間、地域的限制開(kāi)展省際、國(guó)家之間的優(yōu)秀種豬的遺傳物質(zhì)交流，進(jìn)行后裔測(cè)定后選擇優(yōu)良種豬，降低血緣更新、引種等生產(chǎn)成本等方面的巨大優(yōu)勢(shì)。但是也存在解凍后精液質(zhì)量不佳，繁殖成績(jī)不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本高，應(yīng)用設(shè)備條件要求高，受輸精環(huán)境影響大等一系列的問(wèn)題。并且國(guó)際上較多的冷凍精液供應(yīng)企業(yè)對(duì)豬精液的稀釋、冷凍、解凍等條件都不一致，導(dǎo)致行業(yè)內(nèi)缺乏通用的冷凍精液使用規(guī)程，豬冷凍精液應(yīng)用效果評(píng)估也較少。為了更好地開(kāi)展育種工作，提高遺傳進(jìn)展，廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng)開(kāi)展了一系列加裕公司豬冷凍精液的應(yīng)用研究，為規(guī)?；i場(chǎng)的豬冷凍精液應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 材料與方法

1．1．1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

1）豬冷凍精液：由加拿大加裕公司進(jìn)口；

2）試驗(yàn)動(dòng)物：廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng)3～5胎齡新美系大白、長(zhǎng)白、杜洛克種母豬；

3）設(shè)備及耗材：液氮儲(chǔ)存罐、長(zhǎng)臂手套、凍精稀釋粉、去離子水、80 mL深部輸精瓶、燒杯若干、恒溫水浴鍋、3 L容量保溫杯、計(jì)時(shí)器、長(zhǎng)鉗子或大鑷子、紙巾、剪刀、紅外線(xiàn)溫度探測(cè)儀、磁力攪拌器、移液器等。

1．1．2 試驗(yàn)地點(diǎn)和時(shí)間

1）試驗(yàn)地點(diǎn)：廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng)第二種豬場(chǎng)（傳統(tǒng)飼養(yǎng)方式）、第四種豬場(chǎng)（全程空氣過(guò)濾模式）；

2）試驗(yàn)時(shí)間：2016年6月9日—2016年12月18日；2016年9月10日—2017年1月22日。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作規(guī)范

在第二原種豬場(chǎng)選擇約50頭健康的正常發(fā)情的3～5胎齡經(jīng)產(chǎn)母豬（新美系大白、長(zhǎng)白）進(jìn)行純繁，在第四原種豬場(chǎng)選擇約100頭健康的正常發(fā)情的3～5胎齡經(jīng)產(chǎn)母豬（新美系大白、長(zhǎng)白、杜洛克）進(jìn)行純繁，按照生產(chǎn)批次陸續(xù)開(kāi)展豬冷凍精液的人工授精，基礎(chǔ)日糧與其余母豬相同。每頭母豬配種2次，妊娠30 d時(shí)B超檢查受胎情況，母豬分娩時(shí)記錄產(chǎn)仔總數(shù)、健仔數(shù)、畸形數(shù)、死胎數(shù)、木乃伊胎等。觀(guān)察豬群健康狀況、采食情況、糞便情況等，保持圈舍通風(fēng)、衛(wèi)生、干燥，日常飼養(yǎng)管理和免疫消毒程序、疾病的治療與防治按豬場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)返情、空胎豬只時(shí)記錄時(shí)間，并在試驗(yàn)記錄中做好標(biāo)識(shí)。

同期使用鮮精進(jìn)行常規(guī)人工授精并純繁的母豬，設(shè)為對(duì)照組。

1.3 豬冷凍精液的解凍及稀釋

1）從液氮中取出1～2支冷凍精液麥管（0．5 mL/ 支），立即轉(zhuǎn)入 38℃水浴鍋中解凍；

2）將麥管在 38℃下解凍 20 s，立即取出冷凍精液，解凍時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則易導(dǎo)致精子死亡；

3）用干凈面巾紙擦干冷凍精液麥管外部；

4）晃動(dòng)精液麥管將氣泡移至將要開(kāi)口的一端(上端)；

5）豎直麥管，用剪刀剪開(kāi)上端，避免精液與剪刀的接觸；

6）倒轉(zhuǎn)麥管于事先預(yù)熱至26℃的精液管，剪開(kāi)精液管另一端棉塞，將精液從吸管倒入精液瓶中。8支冷凍精液為一個(gè)輸精頭份，最終獲得精液精子數(shù)量為每劑40億精子；

7）緩慢加入預(yù)熱至26℃解凍稀釋劑 60 mL ；

8）封好輸精瓶備用，運(yùn)輸至配種舍時(shí)不能劇烈搖晃；

9）解凍稀釋液配制：把50 g Androhep?CryoGaurd ?-Thaw粉劑溶解于1 L預(yù)溫至26℃的去離子水中，讓酸堿度(pH)穩(wěn)定后(1 h)再作為稀釋劑。不能將剩余的稀釋劑冰凍后再使用。如果使用不足1 000 mL時(shí)，可按照配制比例1 g溶解于20 mL去離子水中進(jìn)行配制。

1.4 凍精品質(zhì)的檢測(cè)

將凍精解凍后孵育10 min后取10 uL樣品于預(yù)熱至37℃的載玻片上，加蓋玻片用精子分析儀觀(guān)測(cè)精子活力和快速直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)精子比例，選擇活力≥20%的精液進(jìn)行輸精試驗(yàn)。

1.5 使用解凍的精液進(jìn)行授精及注意事項(xiàng)

1)由于解凍后精子的活力比鮮精有較大程度的下降，精液應(yīng)在解凍后20 min 內(nèi)使用 ；

2)配種母豬應(yīng)選擇斷奶后4～6 d正常發(fā)情的3～5胎經(jīng)產(chǎn)母豬，在發(fā)情后24 h、36 h各輸精一次，異常發(fā)情、返情的母豬不宜用冷凍精液配種；

3)后備母豬最佳效果在第3次發(fā)情期，發(fā)情后12 h、24 h各輸精一次；4)使用冷凍精液配種時(shí)必須采用子宮頸深部輸精法。

1.6 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)

使用KFnets軟件記錄每頭母豬的與配公豬、配種時(shí)間、B超妊檢結(jié)果，分娩時(shí)間、分娩結(jié)果等。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組母豬繁殖情況進(jìn)行比較。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其中P＜0．05表示差異顯著，P＜0．01表示差異極顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 第二種豬場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知：第二種豬場(chǎng)在6月9日—7月15日，場(chǎng)內(nèi)總計(jì)配種511頭，其中豬冷凍精液人工授精51頭，純繁配種頭數(shù)95頭，配二元雜365頭。凍精的精子在37℃下復(fù)蘇3～5 min后鏡檢活力在0．44±0．22，常規(guī)輸精的精子活力 0．82±0．11。純繁的繁殖成績(jī)?yōu)槭芴ヂ?2．71%，分娩率 86．46%，冷凍精液配種母豬的繁殖成績(jī)?yōu)槭芴ヂ?2．94%，分娩率49．02%?？ǚ綑z驗(yàn)表明，冷凍精液配種母豬的受胎率、分娩率等均與同期的純繁相比差異極顯著，冷凍精液配種只有常規(guī)人工授精成績(jī)的57%左右。

由表2可知：第二種豬場(chǎng)豬冷凍精液窩均產(chǎn)仔總數(shù)9．12頭、活仔數(shù)7．48頭，本場(chǎng)同期純繁窩均產(chǎn)仔總數(shù)11．86頭、活仔數(shù)10．05頭。冷凍精液配種母豬的產(chǎn)仔總數(shù)、活仔數(shù)等均與同期的純繁相比差異極顯著，冷凍精液配種只有常規(guī)人工授精成績(jī)的74%～76%左右?；钭新蕛烧卟町惒伙@著，但是凍精組仍比常規(guī)組少2．7個(gè)百分點(diǎn)。

由表3可知：豬冷凍精液組出生窩重、斷奶窩重、斷奶均頭重、哺乳仔豬成活率等成績(jī)分別為 11．79k g、50．17 kg、7．6 kg、92．74%， 本 場(chǎng) 同期 純 繁 成 績(jī) 為 13．71 kg、60．79 kg、6．85 kg、90．55%。冷凍精液配種母豬的出生窩重、斷奶窩重等比同期的純繁成績(jī)低14%～18%，但是冷凍精液組哺乳仔豬斷奶均頭重比同期的純繁成績(jī)高0．75 kg/頭，成活率比同期的純繁成績(jī)高2．2%，可能是冷凍精液組帶仔數(shù)少于對(duì)照組所導(dǎo)致。公母豬比例中母豬數(shù)凍精組比常規(guī)組高24%。

2.2 第四種豬場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知：第四種豬場(chǎng)在2016年9月10日—2017年1月22日，場(chǎng)內(nèi)總計(jì)配種1 301頭，其中豬冷凍精液人工授精99頭，全部種豬都是純繁配種。凍精的精子在37℃下復(fù)蘇3～5 min后鏡檢活力在0．58±0．18，常規(guī)輸精的精子活力0．77±0．17。常規(guī)配種的繁殖成績(jī)?yōu)槭芴ヂ?9．95%，分娩率85．44%，冷凍精液配種母豬的繁殖成績(jī)?yōu)槭芴ヂ?6．05%，分娩率69．70%?？ǚ綑z驗(yàn)表明，冷凍精液配種母豬的受胎率、分娩率等均與同期的純繁相比差異極顯著，冷凍精液配種只有常規(guī)人工授精成績(jī)的82%～84%左右。第四種豬場(chǎng)豬冷凍精液組窩均產(chǎn)仔總數(shù)9．74頭、活仔數(shù)7．81頭，本場(chǎng)同期純繁窩均產(chǎn)仔總數(shù)12．09頭、活仔數(shù)9．72頭（含杜洛克）。冷凍精液配種母豬的窩均產(chǎn)仔總數(shù)、健仔數(shù)、出生窩重等均與同期的純繁相比差異極顯著，冷凍精液配種只有常規(guī)人工授精成績(jī)的80%～82%左右，差異極顯著；活仔率均在80%左右，差異不顯著。

3 討論

豬的冷凍精液技術(shù)是人工授精的一項(xiàng)重大的變革，對(duì)開(kāi)展聯(lián)合育種、加快遺傳進(jìn)展、提高優(yōu)秀種豬的利用率有著重大意義。但是這一新技術(shù)的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用還存在不少亟待解決的難題：一是豬精液的冷凍工藝還需要改進(jìn)。國(guó)內(nèi)外較多報(bào)道顯示，冷凍精液的稀釋液與冷凍保護(hù)劑的配制、降溫速度、精液的包裝方法等有著不同的方式與方法，解凍后精液的質(zhì)量也參差不齊。二是豬冷凍精液的解凍方法沒(méi)有進(jìn)行有效的統(tǒng)一。權(quán)凱[4]等直接將5 mL/袋的豬袋裝冷凍精液從液氮中取出，用剪刀剪開(kāi)兩端后投入到40℃盛有BTS常溫保存液的50 mL豬一次性輸精瓶中，在40℃水浴下?lián)u動(dòng)至完全溶解，解凍后，活率均在0．4以上、死精子比例為59%～74%、頂體完整率58．7%～71．6%、有效存活時(shí)間為 50～ 80 min；張渭斌[5]等從液氮罐中取出2～3支0．5 mL/支的細(xì)管迅速投入38℃水浴鍋中解凍30 s，用干凈的紙擦干細(xì)管，剪開(kāi)細(xì)管將精液倒入預(yù)熱至26℃的集精瓶中，然后緩慢加入預(yù)熱至26℃的解凍液，邊加邊搖，先按1：1體積比進(jìn)行低倍稀釋?zhuān)?0 s后再加至所需量，活力最高的達(dá)到（42．4±0．9）%，質(zhì)膜完整率為（47．2±0．3）%，頂體完整率為（46．8±0．4）%。三是進(jìn)行輸精試驗(yàn)的母豬數(shù)量少，且結(jié)論不一致。權(quán)凱等采用三個(gè)品種（長(zhǎng)白、大約克夏、杜洛克）合計(jì)121頭正常發(fā)情的母豬進(jìn)行冷凍精液輸精試驗(yàn)，情期妊娠率為90．2%、窩產(chǎn)仔數(shù)10．6頭、活仔率95．7%，與液態(tài)保存豬精液的人工授精結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0．05）；夏天等[6]經(jīng)液氮儲(chǔ)存的豬精液在52℃水溫下解凍12 s，解凍活力在0．3級(jí)以上，輸精6頭母豬，產(chǎn)仔55頭，平均9．16頭，活仔53頭，平均8．82頭，低于常規(guī)鮮精配種；張渭斌等研究結(jié)果表明冷凍精液平均妊娠率為 72%，產(chǎn)仔數(shù)為（6．64±0．82）頭，顯著低于常規(guī)鮮精水平。

表1 冷凍精液配種母豬配種受胎情況

表2 冷凍精液配種母豬分娩情況

表3 冷凍精液配種母豬產(chǎn)仔生長(zhǎng)性能情況

表4 冷凍精液配種母豬配種受胎情況

試驗(yàn)在第二種豬場(chǎng)開(kāi)展時(shí)，冷凍精液組受胎率、分娩率分別是常規(guī)鮮精組的 57．11%、56．70%，總產(chǎn)仔 9．12頭，健仔7．48頭，是常規(guī)鮮精組的76．90%、74．43%。第四種豬場(chǎng)開(kāi)展時(shí)，冷凍精液配種母豬的繁殖成績(jī)?yōu)槭芴ヂ?6．05%，分娩率69．70%，常規(guī)配種的繁殖成績(jī)?yōu)槭芴ヂ?9．95%，分娩率85．44%，冷凍精液試驗(yàn)組是常規(guī)鮮精組的84．55%、81．58%；冷凍精液組窩均產(chǎn)仔總數(shù)9．74頭、活仔數(shù)7．81頭，本場(chǎng)同期純繁窩均產(chǎn)仔總數(shù)12．09頭、活仔數(shù)9．72頭（含杜洛克），試驗(yàn)組是常規(guī)鮮精組的 80．58%、80．37%。

兩組試驗(yàn)結(jié)果差異的原因可能有以下幾個(gè)方面：

1）冷凍精液的解凍稀釋過(guò)程有差異。第二種豬場(chǎng)精液解凍稀釋實(shí)驗(yàn)室距離儲(chǔ)存冷凍精液的液氮罐距離約1 km，采用保溫杯將冷凍豬精麥管運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的途中會(huì)受到高溫天氣的影響，導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，精子死亡；第四種豬場(chǎng)精液解凍稀釋直接在全環(huán)境控制、空氣過(guò)濾的種公豬站中進(jìn)行，減免掉運(yùn)輸豬精的外部環(huán)境干擾因素；

2）配種時(shí)間不同。第二種豬場(chǎng)精液解凍后配種時(shí)間在夏季早上8：30、下午6：00以后；第四種豬場(chǎng)精液解凍后配種時(shí)間在秋冬季早上7：30、下午5：30以后。配種季節(jié)不同與配種時(shí)間的提前，環(huán)境溫度適宜，能夠減少由于廣西夏季氣溫高對(duì)母豬產(chǎn)生的應(yīng)激。

3）環(huán)境控制不同。第二種豬場(chǎng)未采用全環(huán)境控制，較第四種豬場(chǎng)先進(jìn)的空氣過(guò)濾系統(tǒng)有一定的差距，母豬配種后適宜的環(huán)境有利于受精卵的著床。

4 結(jié)論

試驗(yàn)研究表明，冷凍精液配種母豬的受胎率、分娩率是常規(guī)鮮精組的57%、75%左右，產(chǎn)仔總數(shù)、健仔數(shù)是常規(guī)鮮精組的75%、80%左右。豬冷凍精液的保存、運(yùn)輸、配種時(shí)間以及豬場(chǎng)的環(huán)境控制工藝、生物安全體系模式，會(huì)影響到豬冷凍精液的繁殖成績(jī)。如何縮小豬冷凍精液與常規(guī)鮮精輸精的差距，在規(guī)?；i場(chǎng)推廣豬冷凍精液配種技術(shù)，還需要進(jìn)一步地開(kāi)展研究。