雷公藤內(nèi)酯對(duì)睪丸切除雄性大鼠骨丟失的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究

江亞 詹俊鋒 王林 劉群 劉鍇 陳燕 卞育俊 吳剛 楊祖華*

1. 合肥市第三人民醫(yī)院骨2科，安徽 合肥 230022 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨2科，安徽 合肥 230000 3. 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241000

流行病學(xué)研究表明，隨著年齡的增加，男性股骨頸、髖部和前臂遠(yuǎn)端的骨密度降低，尤其是50歲以后[1]。骨質(zhì)疏松癥被定義為退行性骨骼疾病，其特征在于骨量減少和微結(jié)構(gòu)退化，導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。雖然男性脆性骨折不太常見(jiàn)，但與女性相比，其發(fā)病率和死亡率更高[3]。雷公藤多甙已被廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和強(qiáng)直性脊柱炎等各種疾病[4-6]。雷公藤內(nèi)酯醇是雷公藤多甙的主要成分，以其抗炎和免疫抑制活性而聞名[7]。最近，雷公藤內(nèi)酯的心血管保護(hù)和抗腫瘤特性引起了研究人員的注意，此外，雷公藤也因其對(duì)其他病理狀況的潛在有益作用而引起研究人員的注意[8]。最近的研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇能夠通過(guò)抑制破骨細(xì)胞發(fā)育所需的RANKL誘導(dǎo)的NF-κB活化來(lái)抑制破骨細(xì)胞形成，進(jìn)一步研究表明雷公藤內(nèi)酯醇可以預(yù)防大鼠模型中鈦顆粒引起的局部骨質(zhì)疏松癥的作用[8]。

基于上述所述，雷公藤內(nèi)酯顯示出對(duì)骨丟失疾病的潛在影響。然而，雷公藤內(nèi)酯對(duì)治療男性骨質(zhì)疏松癥的潛在治療作用尚未被研究。因此，筆者進(jìn)行了這項(xiàng)體內(nèi)研究觀察雷公藤內(nèi)酯對(duì)睪丸切除雄性大鼠骨丟失的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和治療

3月齡體重230～260 g雄性Sprague-Dawley大鼠，購(gòu)自上海動(dòng)物史萊克公司。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，將30只大鼠隨機(jī)分為3組即對(duì)照組(Sham組)、睪丸切除組(CON組)和雷公藤內(nèi)酯治療組(LGT組)，每組 10大鼠。睪丸切除組和雷公藤內(nèi)酯治療組雙側(cè)睪丸均被切除，而對(duì)照組陰囊被打開(kāi)但睪丸被保留。雷公藤內(nèi)酯治療組術(shù)后大鼠腹腔注射上海純優(yōu)生物提供的雷公藤內(nèi)酯醇15μg/(kg·d)，對(duì)照組和睪丸切除組每日皮下注射等量生理鹽水(0.9%氯化鈉的雙蒸水)，治療共12周。所有實(shí)驗(yàn)期間大鼠均飼養(yǎng)在23 ℃恒溫條件下12 h光暗循環(huán)的房間中，且所有大鼠都可以自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物飲食。治療結(jié)束后，處死所有大鼠。當(dāng)大鼠處于麻醉狀態(tài)時(shí)通過(guò)心臟穿刺收集血液，并收集左側(cè)脛骨進(jìn)行分析。

1.2 Micro-CT掃描

通過(guò)Micro-CT(SkyScan 1176，Bruker-MicroCT，Kontich，比利時(shí))將每組5只大鼠用于測(cè)量脛骨近端中的小梁骨結(jié)構(gòu)。在相同條件(分辨率：18 mm，源電壓：65 kV，源電流：385 μA，旋轉(zhuǎn)步驟：0.7°)下掃描所有骨骼。對(duì)整個(gè)脛骨進(jìn)行掃描，并且對(duì)每個(gè)Micro-CT平掃圖像繪制骨小梁區(qū)域。掃描后，將Micro-CT圖像數(shù)據(jù)傳輸?shù)焦ぷ髡?，并通過(guò)Micro-CT系統(tǒng)中的軟件進(jìn)行分析。評(píng)估骨小梁微結(jié)構(gòu)的以下參數(shù)，如骨密度(bone mineral density，BMD)，骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目和骨小梁分離度，具體操作步驟參考文獻(xiàn)[9]。

1.3 骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)檢測(cè)

收集的血液以3000 rpm離心10 min以提取血清。它被存儲(chǔ)在-20 ℃冰箱中直到分析。 根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用酶聯(lián)免疫吸附通過(guò)中國(guó)武漢精細(xì)生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒檢測(cè)血清1型前膠原氨基末端前肽(type 1 procollagen amino terminal propeptide，P1NP)和I型膠原羧基端肽(type I collagen carboxy terminal peptide，CTX-1)濃度的水平。

1.4 骨生物力學(xué)檢測(cè)

將包裹在氯化鈉中的右側(cè)脛骨進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試。將樣品放置在37 ℃±0.9%氯化鈉中12 h，然后進(jìn)行測(cè)試。對(duì)每個(gè)樣品在8874型號(hào)力學(xué)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲測(cè)試(美國(guó)馬薩諸塞州諾伍德的Instron公司)，主載荷跨度為14.5 mm。以0.1 mm/s的位移速率將骨載荷至出現(xiàn)骨折，并測(cè)量載荷和位移。測(cè)試后，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，從載荷-變形曲線計(jì)算極限載荷(N)，能量(J)和剛度(N/mm)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨密度的改變

圖1 各組大鼠手術(shù)12周時(shí)脛骨骨密度注：和Sham組比較，*P<0.05；和CON組比較，#P<0.05。Fig.1 Tibia bone density at 12 weeks after surgery in all groups

手術(shù)及治療12周，3組大鼠脛骨的骨密度見(jiàn)圖1，切除睪丸后12周，CON組較Sham組大鼠的骨密度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后使用雷公藤治療的LGT組其骨密度較CON組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；這表明雷公藤對(duì)去睪丸雄性大鼠的骨密度有一定的保護(hù)作用。

2.2 Micro-CT檢測(cè)結(jié)果

手術(shù)12周時(shí)大鼠的脛骨Mciro-CT掃描結(jié)果見(jiàn)圖2，微觀參數(shù)見(jiàn)圖3。與Sham組相比， CON組的脛骨骨量和小梁厚度顯著降低(P<0.05)；CON組的小梁間距增加(P<0.05)，而LGT的上述指標(biāo)明顯優(yōu)于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)顯示，LGT對(duì)去卵巢大鼠脛骨骨量有保護(hù)作用。

圖3 治療12周后大鼠脛骨微觀參數(shù)比較注：和Sham組比較，*P<0.05；和CON組比較，#P<0.05。Fig.3 Microscopic parameters of tibia in rats after 12 weeks of treatment

2.3 生物力學(xué)性能

生物力學(xué)測(cè)試獲得的數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4，Sham組具有最高的極限載荷、能量和剛度；與CON組比較，LGT組極限載荷、能量和剛度明顯增加，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 治療12周后大鼠脛骨Micro-CT掃描結(jié)果Fig.2 Micro-CT scans of tibia in rats after 12 weeks of treatment

2.4 治療后大鼠血清CTX-1和P1NP的影響

治療后大鼠血清CTX-1和P1NP的變化見(jiàn)圖5。與Sham組比較，CON和LGT組的CTX-1和P1NP顯著增加(P<0.05)。 LGT組的CTX-1和P1NP較CON組明顯降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05)。

3 討論

圖4 治療對(duì)大鼠股骨生物力學(xué)的影響注：和Sham組比較，*P<0.05；和CON組比較，#P<0.05。Fig.4 Effects of treatment on femur biomechanics

圖5 治療對(duì)大鼠血清CTX-1和P1NP的影響注：和Sham組比較，*P<0.05；和CON組比較，#P<0.05。Fig.5 Effects of treatment on serum CTX-1 and P1NP.

在目前的研究中，本研究結(jié)果表明腹腔注射雷公藤內(nèi)酯能夠抑制破骨細(xì)胞，從而防止老年大鼠脛骨骨質(zhì)流失和改善小梁微結(jié)構(gòu)。老年性骨質(zhì)疏松癥正在成為一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題，因?yàn)樗鼘?dǎo)致脆性骨折增加，并伴隨高昂的醫(yī)療和社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本，亟需有效的策略來(lái)對(duì)抗這種疾病。然而，與年齡相關(guān)的骨丟失和微結(jié)構(gòu)退化的潛在分子機(jī)制仍然知之甚少。許多年齡相關(guān)的變化與炎癥狀態(tài)的升高相關(guān)，炎癥狀態(tài)的升高表明炎癥細(xì)胞因子水平升高，如TNF-α和IL-6。此外，以前的研究表明，炎癥在年齡相關(guān)性骨丟失的病理學(xué)中也發(fā)揮重要作用[10]。更高的循環(huán)C-反應(yīng)蛋白被認(rèn)為是全身炎癥的敏感標(biāo)志物，與老年女性的骨密度降低相關(guān)[11]。此外，許多促炎細(xì)胞因子如IL-1和IL-6被證明具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、活化和骨吸收的能力[12]。此外，流行病學(xué)研究顯示，在各種炎癥條件下發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。上述結(jié)果支持炎癥顯著促成老年性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)理的理論。因此，抗炎可能是治療老年骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點(diǎn)。雷公藤內(nèi)酯是一種炎癥抑制劑，其抗炎活性已有文獻(xiàn)報(bào)道。由于這種抗炎性質(zhì)，雷公藤內(nèi)酯被廣泛用于治療各種疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征和癌癥。巧合的是，這些疾病與骨質(zhì)流失有關(guān)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)額外的并發(fā)癥。因此，研究雷公藤甲素對(duì)骨骼的影響是有意義的。

一些體外研究顯示，雷公藤內(nèi)酯具有抑制破骨細(xì)胞分化和功能的作用[8]。此外，以前的研究還表明，雷公藤內(nèi)酯醇能夠通過(guò)抑制膠原誘導(dǎo)的小鼠中的破骨細(xì)胞分化和形成來(lái)預(yù)防骨質(zhì)破壞和骨吸收[8]。另外，雷公藤內(nèi)酯被證明具有減弱鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解的能力[8]。以上結(jié)果表明雷公藤甲素可能對(duì)預(yù)防骨質(zhì)流失有潛在的作用。然而，就筆者所知，本研究首先揭示了雷公藤內(nèi)酯在預(yù)防雄性大鼠去除睪丸復(fù)制的骨丟失和改善骨結(jié)構(gòu)的有益作用。為了確定骨重塑中的變化是否可以解釋雷公藤內(nèi)酯對(duì)去除睪丸所致骨丟失的保護(hù)作用，筆者對(duì)脛骨進(jìn)行了Mirco-CT分析。在本研究中，雷公藤甲素對(duì)骨小梁有顯著的影響。本研究確定雷公藤對(duì)去除睪丸所致雄性骨質(zhì)疏松癥大鼠骨丟失確切的保護(hù)作用。

同時(shí)，用雷公藤內(nèi)酯醇治療后，破骨細(xì)胞活性顯著降低，從骨代謝指標(biāo)CTX-1和P1NP水平降低可以反映。這些結(jié)果與有些學(xué)者的研究結(jié)果一致，表明雷公藤內(nèi)酯能夠抑制鈦顆粒介導(dǎo)的骨溶解大鼠模型中的破骨細(xì)胞活性。一般認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥由于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活性之間的失衡而發(fā)生骨丟失。因此，本研究表明雷公藤內(nèi)酯促進(jìn)脛骨骨密度，增加骨強(qiáng)度，并可能通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性改善大鼠骨組織。本研究顯示，雷公藤甲素具有抑制破骨細(xì)胞活性的能力。盡管雷公藤內(nèi)酯被證明對(duì)許多疾病具有許多藥理學(xué)作用，但其相關(guān)的不良反應(yīng)使其不能在臨床實(shí)踐中廣泛使用。然而，越來(lái)越多的研究表明雷公藤內(nèi)酯誘導(dǎo)的毒性取決于劑量和給藥時(shí)間。研究報(bào)道，體內(nèi)雷公藤內(nèi)酯的最小毒性劑量為28 d為50 μg/(kg·d)或49 d為40 μg/(kg·d)[13]。本研究中使用的雷公藤內(nèi)酯劑量為15 μg/(kg·d)，84 d，低于最小毒性劑量。因此本研究中使用的雷公藤甲素劑量為15 μg/ (kg·d)，84 d可能被認(rèn)為是中等和安全的。

總之，在大鼠模型中，雷公藤內(nèi)酯醇以15 μg/(kg·d)的劑量持續(xù)84 d似乎對(duì)于治療性腺功能下降相關(guān)的骨丟失是安全和有效的。此外，雷公藤內(nèi)酯的骨保護(hù)作用似乎部分通過(guò)降低骨轉(zhuǎn)換來(lái)介導(dǎo)的?；谀壳暗难芯?，雷公藤內(nèi)酯可能具有治療老年男性骨質(zhì)疏松癥的潛力。