Ang-1在去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織中表達(dá)變化以及中醫(yī)不同治法對其影響的實(shí)驗(yàn)研究

鄧洋洋 李佳 孫鑫 蔣寧 鄭洪新

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制都十分復(fù)雜。從本研究的角度來看，人體內(nèi)的骨骼是具有高度血管化的組織[1]，由于骨組織微循環(huán)障礙的原因，影響到骨骼內(nèi)環(huán)境的改變，導(dǎo)致骨形成障礙。有研究將骨質(zhì)疏松癥列為血管老化性老年疾病之一[2]。因此本研究以Ang-1為切入點(diǎn)，并且觀察補(bǔ)腎填精、活血化瘀、補(bǔ)腎活血三種不同治法對其的影響，以期進(jìn)一步探究骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制以及更有效的中醫(yī)治法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：SPF級SD大鼠，雌性，3～4月齡，60只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品：①補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方：左歸丸出自《景岳全書》卷五十一新方八陣方。組成：熟地、山藥、枸杞、山茱萸、川牛膝、菟絲子、鹿膠、龜膠。②活血化瘀中藥復(fù)方：身痛逐瘀湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》。組成：秦艽、川芎、紅花、桃仁、甘草、羌活、當(dāng)歸、沒藥、靈脂、牛膝、香附、地龍。③補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方：由左歸丸與身痛逐瘀湯加減。組成：菟絲子、熟地、龜膠、鹿膠、川芎、川牛膝、桃仁、紅花。④陽性對照藥：骨疏康顆粒。主治功效：補(bǔ)腎益氣，活血壯骨。

1.1.3主要試劑和儀器：ELISA試劑盒(美國R&D systems公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)等。雙能X線骨密度分析儀(美國 Lunar公司)以及手術(shù)器械等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件：大鼠購進(jìn)后于SPF級實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，溫度：24 ℃；濕度：40%，照明晝夜明暗交替。按體重分層隨機(jī)分組，正常組10只，其余進(jìn)行造模處理。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動物模型建立：采用一次性手術(shù)摘除大鼠雙側(cè)卵巢造模方法。術(shù)后給與造模大鼠青霉素肌肉注射，連續(xù)注射3 d。存活后進(jìn)行分組。

1.2.3實(shí)驗(yàn)動物分組：術(shù)后3 d將存活大鼠，按體重分層隨機(jī)分為5組，模型空白組，補(bǔ)腎填精組，活血化瘀組，補(bǔ)腎活血組，陽性對照組。

1.2.4實(shí)驗(yàn)給藥方法：實(shí)驗(yàn)動物分組2 d后開始給藥，各個(gè)用藥組藥量按人體公斤體重(g/kg)每日用藥量的6.3 倍計(jì)算，體積為1 mL/100 g，正常組、模型空白組給予等量生理鹽水，給藥12 周。

1.2.5標(biāo)本采集與檢測：給藥12 周后，各組大鼠在24 h禁食后采集大鼠雙側(cè)股骨。左側(cè)股骨取出后，生理鹽水沖洗，紗布包好后封于塑料保鮮密封袋，應(yīng)用雙能X線骨密度分析儀對大鼠離體左側(cè)股骨進(jìn)行骨密度檢測。右側(cè)股骨取出后，一部分用錫紙包好后，存入-70°冰箱保存，用于骨組織Ang-1蛋白含量測定，具體檢測步驟按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。一部分放入有Trizol液的EP管中，用于骨組織Ang-1 mRNA表達(dá)測定，使用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，引物序列見下表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨骨密度結(jié)果

實(shí)驗(yàn)各組大鼠骨密度結(jié)果，見表2，與正常組比較，模型空白組大鼠骨密度顯著降低(P<0.01)，說明骨質(zhì)疏松癥模型造模成功。用藥12周后，補(bǔ)腎填精組、活血化瘀組、補(bǔ)腎活血組以及陽性藥物對照組均可以提高大鼠股骨骨密度，與模型空白組相比，其中補(bǔ)腎填精組、補(bǔ)腎活血組以及陽性藥物對照組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，活血化瘀組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方、活血化瘀中藥復(fù)方、補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方均具有提高去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨密度，防止骨質(zhì)丟失的作用。

表2 各組大鼠股骨骨密度檢測結(jié)果比較Table 2 Comparison of BMD of the femur among

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型空白組比較，##P<0.01。

2.2 各組大鼠骨組織中Ang-1mRNA及其蛋白表達(dá)

各組大鼠股骨中Ang-1mRNA見表3和4。與正常組比較，模型空白組大鼠Ang-1mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與模型空白組比較，各個(gè)用藥組即補(bǔ)腎填精組、活血化瘀組、補(bǔ)腎活血組以及陽性對照組均顯著升高(P<0.01)；各個(gè)用藥組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

各組大鼠股骨中Ang-1蛋白：與正常組比較，模型空白組大鼠Ang-1含量顯著降低(P<0.01)；與模型空白組比較，各個(gè)用藥組即補(bǔ)腎填精組、活血化瘀組、補(bǔ)腎活血組以及陽性對照組均顯著升高(P<0.01)；各個(gè)用藥組間比較，補(bǔ)腎活血組Ang-1含量升高最為顯著，與補(bǔ)腎填精組和活血化瘀組比較有顯著性差異(P<0.01)，此外，補(bǔ)腎填精組Ang-1蛋白表達(dá)含量顯著高于活血化瘀組(P<0.01)。

表3 大鼠股骨中Ang-1mRNA相對表達(dá)量結(jié)果Table 3 The expression of Ang-1 mRNA of the

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型空白組比較，##P<0.01。

表4 大鼠股骨中Ang-1蛋白含量結(jié)果Table 4 The expression of Ang-1 protein of the

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型空白組比較，##P<0.01；與補(bǔ)腎填精組比較，●●P<0.01；與活血化瘀組比較，◆◆P<0.01。

3 討論

3.1 骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)病因病機(jī)——腎虛血瘀、血不養(yǎng)骨

中醫(yī)歷代文獻(xiàn)中沒有骨質(zhì)疏松癥的病名，但從其發(fā)病和癥狀上看，多屬于“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”等范疇?！端貑枴ば魑鍤狻氛f：“腎主骨”，又《靈樞·經(jīng)脈》說：“足少陰氣絕，則骨枯”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為精是人體生命活動中最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，藏之于腎，腎精是人體生長發(fā)育及各種生理功能的源泉物質(zhì)。人體的骨骼得到充足的腎精滋養(yǎng)才能正常的發(fā)育生長或維持堅(jiān)實(shí)的狀態(tài)，如果骨失去腎精的充養(yǎng)，可導(dǎo)致骨骼的生長障礙或退化，造成骨質(zhì)疏松癥。另一方面，《素問·五藏生成》說：“足受血而能步，掌受血而能握，指受血而能攝?！闭f明人體骨骼等全身各個(gè)部分必須有血液的供應(yīng)才能發(fā)揮正常的生理功能?！熬础?，即腎精化血，血又化精，故血液濡養(yǎng)骨骼也是“腎主骨”的重要生理表現(xiàn)之一。如精血不足或瘀血阻滯等各種原因，血液不養(yǎng)骨骼和骨髓，骨骼失于充養(yǎng)，也可造成骨質(zhì)疏松癥。由此可見，骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)病因病機(jī)主要在于腎虛血瘀、血不養(yǎng)骨。所以針對上述病因病機(jī)本次實(shí)驗(yàn)采用補(bǔ)腎填精、活血化瘀以及補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方進(jìn)行干預(yù)治療，并且觀察三種不同治療方法的療效比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，補(bǔ)腎填精、活血化瘀以及補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方均可以提升大鼠股骨骨密度，促進(jìn)骨骼修復(fù)，對骨質(zhì)疏松癥起到防止的作用。

3.2 Ang-1和Hedgehog信號與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生機(jī)制與Hedgehog信號傳導(dǎo)通路中SHH、GLI1 mRNA和蛋白活性下降有關(guān)；補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方、活血化瘀中藥復(fù)方、補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方通過激活Hedgehog信號傳導(dǎo)通路中的SHH、GLI1，以促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，起到防止骨質(zhì)疏松癥的作用[3]。有國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路被激活后，可以調(diào)控其下游相關(guān)基因如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素(Ang-1)等[4]。在動物骨骼肌后肢缺血模型中，缺血組織處間充質(zhì)干細(xì)胞中Shh mRNA和蛋白表達(dá)增多，Shh誘導(dǎo)新生血管形成，上調(diào)血管生長因子如VEGF和血管形成素Ang-1的表達(dá)，促進(jìn)缺血處肌肉再生，有利于缺血肢體功能恢復(fù)[5]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，骨是高度血管化的組織，骨新生依賴良好的血供和營養(yǎng)支持，血管和骨細(xì)胞之間緊密的時(shí)空聯(lián)系維持了骨骼的完整性。因此，在骨骼發(fā)展和骨折修復(fù)期間，血管形成起著相當(dāng)重要的作用。同樣，在傳統(tǒng)輸送盤牽張成骨過程中要求各骨段上要有充足的血液供應(yīng)，以保證牽張過程中旺盛的代謝活動、超常的營養(yǎng)供應(yīng)及各骨段組織的正常代謝[6]。

那么，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生是否與血管生成素的變化有關(guān)，而骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)病因病機(jī)表明腎精-骨-血之間具有緊密的聯(lián)系，因此本研究，選取Ang-1作為觀察指標(biāo)，試探究骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制與其關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：正常大鼠骨組織中可以表達(dá)Ang-1，與正常組比較，模型空白組大鼠Ang-1mRNA相對表達(dá)量顯著降低；說明模型空白組大鼠骨骼血供能力減弱，骨失所養(yǎng)，而發(fā)生了骨質(zhì)疏松癥。與模型空白組比較，各個(gè)用藥組均能使Ang-1 mRNA相對表達(dá)量顯著升高，說明通過12周灌胃給藥后，補(bǔ)腎填精、活血化瘀、補(bǔ)腎活血法進(jìn)行治療可以提高大鼠骨組織中Ang-1的生成。正常大鼠骨組織中可以表達(dá)Ang-1蛋白，與正常組比較，模型空白組大鼠Ang-1含量顯著降低；與模型空白組比較，各個(gè)用藥組即Ang-1含量顯著升高；各個(gè)用藥組間比較，補(bǔ)腎活血組Ang-1含量升高最為顯著，與補(bǔ)腎填精組和活血化瘀組比較有顯著性差異。說明，針對去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的干預(yù)治療中，以補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方療效最為顯著，優(yōu)于補(bǔ)腎填精組和活血化瘀組。這說明針對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的治療，可以采用以補(bǔ)腎填精法為主，輔以活血化瘀，達(dá)到更優(yōu)化的治療。