植物過敏性反應(yīng)分子機(jī)制研究進(jìn)展

向婧姝

(貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550004)

植物隨時(shí)面臨著自然界各種各樣的威脅，卻不能像動(dòng)物一樣通過移動(dòng)來躲避，但在與病原物長期的相互博弈中僅有少數(shù)植物被成功侵染，這是因?yàn)橹参镌陂L期的進(jìn)化過程中形成了一套有效的免疫防衛(wèi)機(jī)制[1]。

植物外表皮有角質(zhì)層、蠟質(zhì)層、細(xì)胞壁等物質(zhì)覆蓋，組成了一道天然屏障，抵御了大部分病原微生物的侵襲。這道屏障是植物的第一道防線，又稱被動(dòng)抗性，對(duì)所有的病原物都有效[2]。植物的免疫反應(yīng)，又稱主動(dòng)抗性，是在被病原物侵染后誘發(fā)的，主要有先天免疫反應(yīng)和后天免疫反應(yīng)2類,先天免疫反應(yīng)包括病原物相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)激發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity, PTI)、效應(yīng)因子(effector)激發(fā)的免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity, ETI)[3]；后天免疫反應(yīng)也有2類：系統(tǒng)性獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)[4]和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance, ISR)[5]。

當(dāng)病原物突破植物的第一道防線后，位于細(xì)胞膜上的模式識(shí)別受體(patten recognition receptors, PRRs)能夠識(shí)別PAMPs，激發(fā)植物的免疫反應(yīng)PTI[6]。PAMPs是病原微生物的重要組成部分，是在進(jìn)化上高度保守的分子結(jié)構(gòu)，例如鞭毛蛋白、延伸因子、幾丁質(zhì)等[7]。病原物會(huì)產(chǎn)生效應(yīng)因子來干擾PTI，導(dǎo)致植物感病，稱為效應(yīng)因子激發(fā)的感病性(effector-triggered susceptibility, ETS)。但同時(shí)植物也有響應(yīng)機(jī)制，植物進(jìn)化出了專一性識(shí)別效應(yīng)因子的抗性基因(resistance gene,R基因)，其編碼的蛋白具有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和亮氨酸重復(fù)區(qū)(nucleotide binding, NB和leucine rich repeat, LRR domains，即NB-LRR結(jié)構(gòu))。該蛋白能夠?qū)Ｒ恍宰R(shí)別病原物的效應(yīng)因子，激發(fā)植物的ETI免疫反應(yīng)，ETI可以加速并放大PTI反應(yīng)，導(dǎo)致植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，同時(shí)在侵染點(diǎn)附近會(huì)產(chǎn)生局部的細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)來抑制病原物擴(kuò)散，即過敏性反應(yīng)(hypersensitive response, HR)。病原物會(huì)繼續(xù)進(jìn)化出新的效應(yīng)因子來避免植物的ETI反應(yīng)，而植物也會(huì)隨之進(jìn)化出新的抗性蛋白來識(shí)別[8]。Jones等(2006)據(jù)此提出了一個(gè)拉鏈模式(zigzag model)來解釋植物與病原物的互作過程[8]，如圖1所示。

圖1 植物與病原物互作的拉鏈模式

1 植物過敏性反應(yīng)

病原物與植物的相互作用有2種：親和互作(compatible interaction)引起植物感??；不親和互作(incompatible interaction)導(dǎo)致植物抗病。植物過敏性反應(yīng)(hypersensitive response, HR)是植物與病原物不親和互作時(shí)，植物產(chǎn)生的一種防衛(wèi)反應(yīng)。過敏性反應(yīng)這一概念最早由Stakman(1915)提出，用來描述銹病在其谷類抗病品種上形成的快速、局部的植物細(xì)胞死亡[9]。后來人們研究發(fā)現(xiàn)HR反應(yīng)與植物的抗病性相關(guān)，在植物遭受病原菌侵襲后，植物受侵染點(diǎn)以及鄰近組織快速壞死，從而限制病原菌的生長[10]。植物過敏性反應(yīng)是一種細(xì)胞程序性死亡(PCD)，主要包括植物識(shí)別病原菌、植物細(xì)胞死亡、抗病反應(yīng)的激發(fā)、病原菌生長的抑制這4個(gè)方面[11]。

根據(jù)Flor(1971)提出的“基因?qū)颉奔僬f[12]，植物R基因編碼的產(chǎn)物特異性地識(shí)別病原物無毒基因(avirulence gene)編碼的產(chǎn)物并相互作用，在侵染點(diǎn)就會(huì)產(chǎn)生過敏性反應(yīng)[13]。目前已經(jīng)有很多研究證實(shí)了這一假說，Tang等(1997)發(fā)現(xiàn)番茄抗性基因Pto產(chǎn)物和無毒基因AvrPto編碼產(chǎn)物在分子水平互作[14]；Jia等(2000)利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)稻瘟菌的無毒基因AvrPita和水稻抗性基因Pita也能互作[15]；Leister等(2000)發(fā)現(xiàn)擬南芥抗性基因RPS32蛋白和無毒基因AvrRpt2表達(dá)產(chǎn)物在葉肉的原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)時(shí)會(huì)發(fā)生免疫共沉淀[16]。

除了無毒基因編碼的產(chǎn)物會(huì)在植物上引起過敏性反應(yīng)外，一些激發(fā)子(elictor)也能引起HR反應(yīng)，激發(fā)植物的抗病反應(yīng)。Wei等(1992)從梨火疫病菌中分離到的蛋白質(zhì)激發(fā)子harpin，能引起煙草的過敏性反應(yīng)[17]。Kulye等(2012)從極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)中分離出一個(gè)蛋白質(zhì)激發(fā)子Hrip1，能引起煙草的過敏性反應(yīng)，并增強(qiáng)對(duì)煙草花葉病毒(TMV)的抗性[18]。Chang等(2014)從寄生疫霉上分離到一個(gè)蛋白質(zhì)激發(fā)子OPEL，可以在煙草上引起HR，并增強(qiáng)植物的基礎(chǔ)抗性[19]。

過敏性反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)，時(shí)常會(huì)伴隨著一些相關(guān)的抗性事件，例如活性氧爆發(fā)、離子流、一氧化氮的產(chǎn)生、胼胝質(zhì)積累、細(xì)胞外pH值升高、細(xì)胞壁木質(zhì)化加厚、病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)的表達(dá)等[20-21]。這些抗性反應(yīng)最早出現(xiàn)在侵染點(diǎn)細(xì)胞，爾后擴(kuò)散到鄰近的沒有被侵染的細(xì)胞，最后擴(kuò)散到整株植物產(chǎn)生SAR抗性反應(yīng)，使得植物能夠抵抗多種病原物[22]。

2 活性氧與植物抗病

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一類高氧化性物質(zhì)的總稱，主要包括過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)、羥基自由基(·OH)、單線態(tài)氧(1O2)、脂氫過氧化物(ROOH)等，主要來源于葉綠體和線粒體的一些酶促反應(yīng)[23]。

植物自身有著良好的酶促清除系統(tǒng)和非酶清除系統(tǒng)，ROS在植物體內(nèi)通常處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以維持植物自身正常的生理代謝[24]。當(dāng)植物遭受到來自外界環(huán)境(如逆境、病原物侵害等)或自身的氧化脅迫時(shí)，活性氧會(huì)在植物體內(nèi)大量積累。ROS作為有氧代謝副產(chǎn)物會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[25]，高濃度時(shí)甚至?xí)斐芍仓晁劳?。但是活性氧同時(shí)也是一種信號(hào)分子，它作為第二信使調(diào)節(jié)著植物的新陳代謝。例如H2O2對(duì)擬南芥etr1-7乙烯受體功能缺失突變體中的氣孔關(guān)閉起到干擾作用[26]。

活性氧爆發(fā)被認(rèn)為是植物與病原物互作的早期事件之一，Doke(1983)首先發(fā)現(xiàn)在病原物與植物的非親和性互作中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS[27]。他用致病疫霉(Phytophthorainfestans)接種馬鈴薯，在發(fā)生過敏性反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)到了活性氧的產(chǎn)生，在不能引起過敏性反應(yīng)的馬鈴薯中沒有檢測(cè)到活性氧，因此他認(rèn)為ROS的產(chǎn)生與過敏性反應(yīng)有直接的關(guān)系[27]。這一觀點(diǎn)在后來的許多研究中得到證實(shí)。Vera-Estrella等(1992)用番茄葉霉病菌(Cladosporiumfulvum)侵染番茄，從發(fā)生HR反應(yīng)的番茄葉片中提取細(xì)胞液感染同種番茄的懸浮細(xì)胞，產(chǎn)生了大量活性氧；但用沒有發(fā)生HR反應(yīng)的番茄葉片細(xì)胞提取液感染番茄懸浮細(xì)胞，其活性氧水平卻不會(huì)升高[28]。Baker等(1993)用火疫病菌(Erwiniaamylovora)侵染煙草懸浮細(xì)胞后產(chǎn)生了Harpin蛋白，引起過敏性反應(yīng)，并產(chǎn)生活性氧爆發(fā)，然而用不能產(chǎn)生Harpin蛋白突變體侵染煙草則不能引起活性氧爆發(fā)[29]。目前普遍認(rèn)為過敏性反應(yīng)中活性氧的產(chǎn)生與植物中的還原型輔酶Ⅱ(NADPH氧化酶)有關(guān)，并受鈣離子調(diào)控[30]。Taniguchi等(2001)發(fā)現(xiàn)因病毒侵染煙草和番茄產(chǎn)生O2-的酶位于質(zhì)膜上，可以與NADPH氧化酶的抗體反應(yīng)，并且該酶活性受Ca2+調(diào)節(jié)[31]。Schwacke等(1992)用真菌侵染云杉細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)除去培養(yǎng)介質(zhì)里的鈣離子會(huì)減少懸浮細(xì)胞中的活性氧水平，因此認(rèn)為Ca2+與ROS的爆發(fā)相關(guān)[32]。

活性氧在植物過敏性反應(yīng)中起了重要作用。首先，ROS在被侵染部位大量積累能直接毒害病原菌，降低其存活力。Keppler等(1989)用Pseudomonassyringaepv.syringae細(xì)菌侵染煙草懸浮細(xì)胞后產(chǎn)生了大量活性氧，明顯減少了細(xì)菌數(shù)量，但在加入SOD活性氧清除劑后細(xì)菌數(shù)量又增加了，同時(shí)延緩了HR[33]。其次，加固細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，H2O2可以引發(fā)細(xì)胞壁木質(zhì)化，增強(qiáng)細(xì)胞壁強(qiáng)度，從而抵抗病原物入侵[34]。第三，活性氧可以誘導(dǎo)植保素(phytoalexin, PA)合成，植保素是在植物受到侵染或外界環(huán)境脅迫時(shí)產(chǎn)生的一類分子量較低的抗微生物化合物[35]。有研究發(fā)現(xiàn)，OH-和H2O2可以誘發(fā)大豆素的合成[36]，O2-可以誘發(fā)馬鈴薯合成日齊素[37]，而外源CAT和SOD等自由基清除劑可以抑制植保素的合成[38]。最后，活性氧能調(diào)控基因表達(dá)。ROS可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)，Desikan等(1998)發(fā)現(xiàn)H2O2能夠誘導(dǎo)擬南芥懸浮細(xì)胞中如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的表達(dá)[39]。

3 胼胝質(zhì)沉積

胼胝質(zhì)(callose)的主要成分是β-l,3-葡聚糖，存在于植物花粉管細(xì)胞、韌皮部篩板、細(xì)胞壁和胞間連絲中，在植物的生長發(fā)育中起著重要的作用[40]。當(dāng)植物受到各種脅迫時(shí)，胼胝質(zhì)可以通過沉積或降解，調(diào)節(jié)胞間連絲瓶頸的膨大或收縮[41]。而當(dāng)病原物侵染植物時(shí)，胼胝質(zhì)會(huì)在細(xì)胞壁沉積，增強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而抵御病原物入侵并抑制病原物的傳播擴(kuò)散[42]。Shimomura等(1975)在TMV侵染粘毛煙草(Nicotianaglutinosa)后20 h(形成壞死斑前)的葉表皮細(xì)胞壁上觀察到了胼胝質(zhì)沉積，壞死斑出現(xiàn)后依然能觀察到大量的胼胝質(zhì)[43]。Luna等(2010)用Flg22處理水培擬南芥后，在葉片中檢測(cè)到了胼胝質(zhì)[44]。Chang等(2014)從寄生疫霉中分離到蛋白質(zhì)激發(fā)子OPEL，其能在煙草上引起過敏性反應(yīng)，用其處理煙草后能檢測(cè)到胼胝質(zhì)沉積[19]。因此，胼胝質(zhì)沉積也被認(rèn)為是植物防御反應(yīng)發(fā)生的一個(gè)重要標(biāo)志。

4 防御相關(guān)酶

植物與病原物不親和互作引發(fā)過敏性反應(yīng)，植物體內(nèi)一些抗病相關(guān)的防御酶活性也會(huì)發(fā)生變化，有研究表明防御相關(guān)酶活性的提升可以提高植物的抗病能力。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是一種普遍存在于植物、昆蟲、真菌中的含銅金屬蛋白酶，廣泛分布于植物的各個(gè)組織中，一般在幼嫩組織中含量較高[45]。PPO由核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)中合成，爾后轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體中行使其功能[46]。當(dāng)植物組織遭到病原物侵襲時(shí)，質(zhì)體內(nèi)的多酚類物質(zhì)會(huì)被PPO氧化生成琨類物質(zhì)，從而發(fā)揮抗病作用。天然狀態(tài)下的多酚氧化酶與內(nèi)囊體膜結(jié)合而沒有活性，只有當(dāng)植物遇到外界刺激時(shí)PPO才會(huì)被激活與內(nèi)囊體膜分離來發(fā)揮抗病作用。Bu等(2014)用蛋白質(zhì)激發(fā)子PevD1處理棉花，誘導(dǎo)其系統(tǒng)抗病性，多酚氧化酶的活性在處理24 h后開始上升，在120 h時(shí)達(dá)到高峰，比對(duì)照組的活性高3～4倍[47]。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是減輕氧化脅迫機(jī)制中的一種重要酶，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)。植物在正常的生理情況下會(huì)不斷產(chǎn)生活性氧，但同時(shí)也會(huì)不斷地清除活性氧以維持動(dòng)態(tài)平衡，這有賴于植物體內(nèi)良好的酶促清除系統(tǒng)，起關(guān)鍵作用的主要有超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶(catalase, CAT)等，其中SOD起主要作用[48]。在過敏性反應(yīng)中，植物會(huì)在瞬間產(chǎn)生大量活性氧而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，限制病原菌擴(kuò)散，而同時(shí)SOD活性也會(huì)升高，從而削弱活性氧和病原菌代謝產(chǎn)物對(duì)植物細(xì)胞的傷害。Sgherri等(2013)發(fā)現(xiàn)葡萄感染了葡萄扇葉病毒后，不僅引發(fā)活性氧大量積累，SOD的活性也會(huì)上升[49]。

5 病程相關(guān)蛋白

病程相關(guān)蛋白(pathogensis-related proteins, PRs)是植物受到病原物或外界脅迫時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，在植物的防御反應(yīng)中起著重要作用[50]。Van Loon等(1970)首次發(fā)現(xiàn)了病程相關(guān)蛋白，他們?cè)?個(gè)煙草品種上接種TMV引起過敏性反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)了4種新的蛋白質(zhì)[51]。隨著研究的深入，許多研究者從不同植物中發(fā)現(xiàn)了類似的蛋白。Antoniw等(1980)將這些蛋白命名為病程相關(guān)蛋白，同時(shí)提出了命名方法[52]，此后病程相關(guān)蛋白的研究得到了極大的發(fā)展。迄今為止，已經(jīng)鑒定了17個(gè)家族的病程相關(guān)蛋白。

病程相關(guān)蛋白與植物的抗病反應(yīng)息息相關(guān)，PRs首先在煙草對(duì)TMV的過敏性反應(yīng)中被發(fā)現(xiàn)[51]，此后的研究也發(fā)現(xiàn)其與植物誘導(dǎo)抗性有關(guān)。Czernic等(1996)發(fā)現(xiàn)煙草和茄假單胞桿菌(Pseudomonassolanacarum)不親和互作時(shí)，一個(gè)過敏性反應(yīng)相關(guān)基因hsr在HR中被激活[53]。Wang等(2015)用從側(cè)短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)分離到的激發(fā)子蛋白PeBL1處理煙草，能引起過敏性反應(yīng)，并提高了煙草的系統(tǒng)抗性，同時(shí)檢測(cè)到了病程相關(guān)蛋白的表達(dá)[54]。

不同的病程相關(guān)蛋白的功能也不盡相同，例如PR-1a、PR-5基因是水楊酸途徑的標(biāo)志基因。煙草的PR-1a蛋白的表達(dá)與煙草的系統(tǒng)獲得抗性密切相關(guān)，Alexander等(1993)把PR-1a基因轉(zhuǎn)到煙草中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PR-1a的高效表達(dá)增強(qiáng)了煙草轉(zhuǎn)基因植株對(duì)煙草霜霉病和煙草黑脛病的抗性[55]。PR-5蛋白是一種類甜蛋白，具有激活植物防衛(wèi)信號(hào)途徑及抵抗真菌侵染等作用[56]。PDF1.2則是茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑的標(biāo)志基因。NPR1基因是各信號(hào)途徑的交叉點(diǎn)，在正常情況下處于失活狀態(tài)，當(dāng)受到外界刺激時(shí)被激活，通過與轉(zhuǎn)錄因子TGA互作，參與PR基因和植物抗病性的調(diào)控[57]。

6 小結(jié)與展望

植物在與病原物的長期博弈過程中，進(jìn)化出了一套有效的免疫防衛(wèi)機(jī)制。過敏性反應(yīng)是植物抗病的典型表現(xiàn)，通過將病原物限制在侵染點(diǎn)，從而抑制其擴(kuò)散?；钚匝醣l(fā)、胼胝質(zhì)沉積、防御相關(guān)酶、病程相關(guān)蛋白的產(chǎn)生是過敏性反應(yīng)的重要標(biāo)志，通過檢測(cè)這些標(biāo)志可以判斷過敏性反應(yīng)的發(fā)生。過敏性反應(yīng)是無毒基因與抗性基因互作的結(jié)果，通過尋找抗性基因，可以深入了解植物抗病的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并且應(yīng)用于作物的遺傳改良，逐步取代化學(xué)防治的方法，解決環(huán)境污染、農(nóng)藥耐藥性等問題。