海洋芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化*

朱祥杰 王 震 苑志欣 郝建華 鄭蘭紅

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海洋芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化*

朱祥杰1,2王 震1,2苑志欣1郝建華1鄭蘭紅1①

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

本研究采用響應(yīng)面法(RSM)對南極海洋芽孢桿菌(sp.)N11-8液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶PBN11-8的發(fā)酵條件進(jìn)行快速優(yōu)化。通過單因素實(shí)驗(yàn)初步確定南極海洋芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的最佳碳源和氮源分別為可溶性淀粉和蛋白胨；并通過Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)對影響其產(chǎn)酶相關(guān)因素進(jìn)行評估，篩選出具有顯著效應(yīng)的3個(gè)因素：溫度、氮源和碳源；以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近至上述因子最大響應(yīng)區(qū)域，進(jìn)而采用RSM法對其最佳水平范圍進(jìn)行研究，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：可溶性淀粉3 g/L，蛋白胨13.1 g/L，酵母浸粉2.9 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO41 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 2 mmol/L，初始pH值為7.0，溫度為34.0℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，裝液量為50 ml/250 ml，接種量為4%，培養(yǎng)時(shí)間為60 h。最終優(yōu)化后的酶活達(dá)到90.5 U/ml，比初始酶活提高了23.6%。

芽孢桿菌；蛋白酶；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鏈的一類酶的總稱，在動(dòng)植物、微生物中均有分布。產(chǎn)蛋白酶的微生物種類主要包括細(xì)菌、霉菌和放線菌等(史翠娟等, 2015)。蛋白酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要用于治療心血管病等疾病，同時(shí)在治療膿毒癥、消化系統(tǒng)疾病、炎癥、囊性纖維化、視網(wǎng)膜疾病和牛皮癬等疾病方面也有所應(yīng)用(Gomis-Ruth, 2003)。目前，在食品、洗滌劑、化妝品及抗腫瘤藥物等和疾病的機(jī)理研究等方面也有諸多應(yīng)用(荊谷等, 2002)。迄今為止，有關(guān)抗腫瘤活性蛋白酶只有少量報(bào)道(Weildle, 2014; 紀(jì)明開等, 2017)。

芽孢桿菌(sp.)N11-8由南極表層海水中分離獲得(Zheng, 2016)，其所產(chǎn)蛋白酶PBN11-8具有較好的應(yīng)用潛力(鄭蘭紅等, 2015)。為獲得更高的產(chǎn)酶量，對芽孢桿菌N11-8的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，其中，正交實(shí)驗(yàn)是一種高效處理多因素優(yōu)化問題的方法，采取部分實(shí)驗(yàn)代替全面實(shí)驗(yàn)(何磊等, 2011; 李洪康等, 2016)。響應(yīng)面法是采用擬合因素響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，精確分析因子與響應(yīng)值關(guān)系以優(yōu)化工藝參數(shù)的方法，適用性強(qiáng)(劉志祥等, 2009)。響應(yīng)面法明顯優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短、精度高等特點(diǎn)，可快速有效確定多因子系統(tǒng)最佳條件(劉志祥等, 2009; 王茜等, 2015)。本研究通過單因素法進(jìn)行前期優(yōu)化，再運(yùn)用響應(yīng)面法建立模型，分析處理驗(yàn)證，確定培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，從而提高蛋白酶活力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng) 芽孢桿菌N11-8由南極表層海水分離獲得(Zheng, 2016)。ND培養(yǎng)基(牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 7)；固體ND培養(yǎng)基(牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH 7)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 葡萄糖、Folin-酚、干酪素等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，蛋白胨(北京雙旋)，可溶性淀粉(汕頭市西隴化工)，酵母浸粉(英國Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶活力測定 采用Folin-酚法測定蛋白酶活力，具體方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527-2009。每毫升酶液在30℃、pH 8條件下水解酪蛋白，每分鐘釋放1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(楊娟等, 2017)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，其他條件不變，依次測定不同碳源、不同氮源、碳源濃度、氮源濃度、磷酸鹽濃度、NaCl濃度、不同金屬離子、金屬離子濃度、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、溫度和初始pH對菌株產(chǎn)酶的酶活影響(馬子賓等, 2015; 張丹等, 2011; 張?jiān)鱿榈? 2010)。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)參照王東等(2016)和梁昌聰?shù)?2014)，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選出7個(gè)對產(chǎn)酶量有較大影響的因子(可溶性淀粉、蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、FeCl3·6H2O、KH2PO4)，設(shè)計(jì)PB實(shí)驗(yàn)(表1、表2)，進(jìn)一步篩選出3個(gè)顯著影響因子。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以蛋白胨、酵母浸粉、溫度為主要影響因素設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基中其他因素分別為可溶性淀粉(3 g/L)、NaCl (5 g/L)、FeCl3·6H2O (2 mmol/L)、KH2PO4(1 g/L)、裝液量(50 ml)，轉(zhuǎn)速(200 r/min)，培養(yǎng)時(shí)間(60 h)(表4)。中心組合實(shí)驗(yàn)分別以蛋白胨添加量、酵母浸粉添加量和溫度為自變量，以蛋白酶的酶活為指標(biāo)進(jìn)行液體發(fā)酵條件優(yōu)化(表5、表6)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Design-Expert軟件(Version 7.0 Stat-Ease Inc., USA)對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析。模型及因素的顯著性均通過值考察(<0.05)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以蛋白酶酶活力表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同碳、氮源對芽孢桿菌N11-8液體發(fā)酵的影響 從圖1a可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)可溶性淀粉為碳源時(shí)，產(chǎn)酶量最高。因此，培養(yǎng)基最適碳源為可溶性淀粉。酶的合成往往受到分解代謝阻遏的控制。葡萄糖等易代謝的碳水化合物對細(xì)菌的蛋白酶產(chǎn)量都有阻遏作用，在實(shí)踐中往往采用代謝緩慢的碳源，或者降低糖濃度并采用連續(xù)流加法(郭軍等, 2003)。圖1b顯示，在實(shí)驗(yàn)選取的7種氮源中，蛋白胨具有最強(qiáng)的競爭力(產(chǎn)酶量最高)。

圖1 不同碳、氮源對芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的影響

2.1.2 不同碳、氮源濃度對芽孢桿菌N11-8液體發(fā)酵的影響 圖2a顯示，隨著可溶性淀粉濃度的不斷增加，產(chǎn)酶量逐漸上升；可溶性淀粉濃度達(dá)到3 g/L時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，可溶性淀粉濃度宜取 3 g/L。從圖2b可以發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白胨濃度的增加，產(chǎn)酶量不斷增加，在蛋白胨濃度達(dá)到15 g/L時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，蛋白胨濃度宜取15 g/L。從圖2c可知，在酵母浸粉濃度達(dá)到2.5 g/L時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，酵母浸粉濃度宜取2.5 g/L。

圖2 不同濃度可溶性淀粉、蛋白胨或酵母浸粉對芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的影響

2.1.3 不同鹽濃度對芽孢桿菌N11-8液體發(fā)酵的影響

圖3a顯示，磷酸鹽濃度在1 g/L時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，磷酸鹽濃度宜取1 g/L。由圖3b可以看出，NaCl濃度在5 g/L時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，NaCl濃度宜取5 g/L。

圖3 不同鹽濃度對芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的影響

2.1.4 金屬離子對芽孢桿菌N11-8液體發(fā)酵的影響

圖4a顯示，當(dāng)加入FeCl3·6H2O時(shí)，產(chǎn)酶量最高，即Fe3+對酶活促進(jìn)作用最強(qiáng)。Fe2+對酶活促進(jìn)作用略低于Fe3+，Ca2+、Al3+、Mn2+對酶活也有一定的促進(jìn)作用，而Mg2+、Cu2+、Zn2+對酶活都有不同程度的抑制作用，尤其Zn2+幾乎可使蛋白酶完全失活。隨著樣品中Fe3+濃度的增加，產(chǎn)酶量不斷增加，當(dāng)達(dá)到2 mmol/L時(shí)，產(chǎn)酶量最高(圖4b)，故培養(yǎng)基中宜添加終濃度為2 mmol/L的FeCl3·6H2O。

圖4 金屬離子對芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的影響

2.1.5 接種量與裝液量對芽孢桿菌N11-8液體發(fā)酵的影響 圖5a顯示，接種量在4%時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，接種量宜為4%。從圖5b可以看出，裝液量在50 ml時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)最高。因此，裝液量宜為50 ml。在較高的裝液量水平時(shí)，產(chǎn)酶量減少，可能主要是由于溶氧較低、供氧不足造成的(陳世建等, 2014)。

圖5 接種量與裝液量對芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的影響

2.1.6 轉(zhuǎn)速與溫度對芽孢桿菌N11-8液體發(fā)酵的影響

圖6a顯示，轉(zhuǎn)速在200 r/min時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，轉(zhuǎn)速宜為200 r/min。圖6b顯示，溫度在35℃時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，溫度宜為35℃。

圖6 不同轉(zhuǎn)速與溫度對芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的影響

2.1.7 初始pH與時(shí)間對芽孢桿菌N11-8液體發(fā)酵的影響 圖7a顯示，初始pH=7時(shí)，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，初始pH宜為7。然而，隨著時(shí)間增加，產(chǎn)酶量不斷增加，并在60 h后趨于穩(wěn)定，產(chǎn)酶量達(dá)到最高。因此，時(shí)間宜為60 h (圖7b)。

圖7 初始pH與時(shí)間對芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件

2.2.1 PB實(shí)驗(yàn)主要因子篩選 如表1所示，從單因素實(shí)驗(yàn)中選取7個(gè)因素：可溶性淀粉濃度、蛋白胨濃度、酵母浸粉濃度、NaCl濃度、FeCl3·6H2O濃度、KH2PO4濃度、溫度，選擇高低2個(gè)水平，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，通過PB實(shí)驗(yàn)為響應(yīng)面優(yōu)化條件篩選出主要影響因子。12組實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表3可知，發(fā)酵條件的顯著影響因子依次為蛋白胨濃度、溫度和酵母浸粉濃度。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因子水平

Tab.1 The level of factors in Plackett-Burman assay

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選主要影響因素

Tab.2 Screening of main influence factors in Plackett-Burman

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析

Tab.3 Statistical analysis of the Plackett-Burman assay

*：差異顯著(<0.05)

*: Significant differences (<0.05)

2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，以蛋白胨、酵母浸粉、溫度為主要影響因素設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。顯然，第4組實(shí)驗(yàn)的單位酶活最高，這說明產(chǎn)酶最優(yōu)點(diǎn)在第4組附近。

2.2.3 中心組實(shí)驗(yàn)確定顯著因素最優(yōu)水平 以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)組第4組為中心，采用二次回歸旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)，進(jìn)一步確定蛋白胨、酵母浸粉、溫度對菌株產(chǎn)酶的影響。具體設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5和表6。

表4 最陡爬坡路徑設(shè)計(jì)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.4 Experimental design and results of steepest ascent and corresponding results

表5 中心組合因素與水平

Tab.5 Factors and coded values of central composite test design

用Design-Expert V 8.0.6對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，<0.0001表明該模型是顯著的，同時(shí)，失擬項(xiàng)=0.0970>0.05表示該模型失擬不顯著，因此，該模型是合適的。另外，此模型2=0.9714，表明該模型能較好地的解釋菌株產(chǎn)酶量的變化。以單位酶活()為因變量，蛋白胨()、酵母浸粉()和溫度()為自變量，建立回歸方程式如下：

表6 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Tab.6 Experimental design and the results of central composite test

表7 響應(yīng)面模型方差分析

Tab.7 Variance analysis of the response surface model

注：2=97.14%，Adj.2=94.56%。<0.05表明模型中各項(xiàng)都是顯著的。*：差異顯著(<0.05)，**：差異高度顯著(<0.01)，***：差異極顯著(<0.001)

Note:2=97.14%, Adj.2=94.56%.<0.05 showed all factors in the model are significant. *: Significant differences (<0.05), **: Highly significant differences (<0.01), ***: Extremely significant differences (<0.001)

酶活=89.56?2.98+2.34?2.96?5.14+1.06+ 0.51?6.712?5.882?7.982

根據(jù)上面的方程繪制響應(yīng)面分析圖、等高線圖(圖8)，直接反映了各因素對酶活的影響。

用Design-Expert V8.0.6計(jì)算，對回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，得出模型極值點(diǎn)。即當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?3.1 g/L、酵母浸粉濃度為2.9 g/L、溫度為34℃時(shí)，酶活力最大，理論最大值為90.8 U/ml。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以上述響應(yīng)面分析得到的最佳培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件下，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測定平均酶活為90.5 U/ml，和理論值90.8 U/ml基本一致，表明方程擬合度很好，驗(yàn)證了模型的正確性。

3 結(jié)論

本研究通過單因素法和響應(yīng)面法對來自南極表層海水的一株海洋芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶PBN11-8的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert建立相應(yīng)數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型合理可靠，能夠較好地預(yù)測并用于優(yōu)化該菌產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件。對影響產(chǎn)酶量的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討后，最終確定了以可溶性淀粉(3 g/L)為碳源，蛋白胨(13.1 g/L)和酵母浸粉(2.9 g/L)為復(fù)合氮源，F(xiàn)e3+(2 mmol/L)為金屬離子，初始pH值為7.0，用NaCl(5 g/L)調(diào)節(jié)鹽度，250 ml三角瓶裝液50 ml，接種量為4%，34℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)60 h，最終優(yōu)化后的酶活達(dá)到90.5 U/ml，比初始酶活73.2 U/ml提高了23.6%。

圖8 不同因素對酶活響應(yīng)值的影響

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Optimization of Fermentation Conditions ofsp. N11-8 on the Production of Protease PBN11-8

ZHU Xiangjie1,2, WANG Zhen1,2, YUAN Zhixin1, HAO Jianhua1, ZHENG Lanhong1①

(1. Key Laboratory of Sustainable Development of Polar Fishery, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

In this study, we optimized fermentation conditions to increase the production of PBN11-8 bysp. N11-8. Response surface methodology (RSM) is a generally available method used to optimize the fermentation conditions of proteases, by fitting factors function relation between response value. The optimal carbon and nitrogen sources for protease production bysp. N11-8 were starch and peptone respectively, which were verified in single-factor experiments. Other optimal fermentation conditions were determined as follows: temperature 35℃, incubation time 60 h, rotational speed 200 r/min, pH 7, initial inoculums 4%, culture volume 50 ml in a 250 ml shake flask, and starch, peptone, yeast extract, NaCl, KH2PO4,and metal ions (Fe3+) concentrations of 3 g/L, 15 g/L, 2.5 g/L, 5.0 g/L, 1.0 g/L, and 2.0 mmol/L, respectively. The Plackett-Burman design (PB) method was used to evaluate factors affecting protease production bysp. N11-8, and three significant factors were identified: temperature, peptone, and yeast extract. Next, we used the steepest ascent design to approach the maximum response area of the three factors. Furthermore, the best scope of fermentation conditions was studied using a central composite test design, which is a type of RSM. Finally, through analysis of variance for the RSM, we obtained a regression equation and calculated the theoretical optimal fermentation conditions as follows: 3 g/L of soluble starch, 13.1 g/L of peptone, 2.9 g/L of yeast extract, 5 g/L of NaCl, 1 g/L of KH2PO4, 2 mmol/L of Fe3+, pH 7.0, temperature 34℃, rotational speed 200 r/min, culture volume 50 ml/250 ml, initial inoculums of 4%, incubation time 60 h. Under the optimized fermentation conditions, the theoretical enzyme activity reached 90.8 U/ml, and in the verification test, enzyme activity reached 90.5 U/ml, which increased 23.6% of the initial enzyme activity.

sp; Protease; Plackett-Burman design; RSM

ZHENG Lanhong, E-mail: zhenglh@ysfri.ac.cn

朱祥杰, 王震, 苑志欣, 郝建華, 鄭蘭紅. 海洋芽孢桿菌N11-8產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(6): 155–163

Zhu XJ, Wang Z, Yuan ZX, Hao JH, Zheng LH. Optimization of fermentation conditions ofsp. N11-8 on the production of protease PBN11-8. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 155–163

* 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2014B01YQ01)和山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014GSF121016)共同資助[This work was supported by the Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Chinese Academy of Fishery Sciences (2014B01YQ01), and the Science and Technology Development Plans of Shandong Province (2014GSF121016)]. 朱祥杰，E-mail: zhuxiangjie1204@163.com

鄭蘭紅，副研究員，E-mail: zhenglh@ysfri.ac.cn

2017-10-09,

2017-11-14

10.19663/j.issn2095-9869.20171009002

S917.1

A

2095-9869(2018)06-0155-09

(編輯 馬璀艷)