河鱸細菌性腸炎致病菌的分離、鑒定及藥敏實驗*

楊昆明 郭愛民 馬江霞 段成任 謝志勝 岳 城

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河鱸細菌性腸炎致病菌的分離、鑒定及藥敏實驗*

楊昆明 郭愛民 馬江霞 段成任 謝志勝 岳 城①

(新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院 烏魯木齊 830052)

河鱸(Linnaeus)是新疆額爾齊斯河特有的土著魚類，已開展人工養(yǎng)殖，但其病害相關研究較少。2016年，五家渠某水產推廣站河鱸突然大批死亡，作者從發(fā)病的河鱸肝臟和腸道分離病原菌，對分離菌進行了傳代純化培養(yǎng)。結果顯示，在20℃培養(yǎng)24 h后，ZL1能形成邊緣整齊、中間微隆起、表面光滑、淺黃色、有特殊芳香氣味、大小為1.5~2 mm的菌落，在血瓊脂平板上能形成明顯的β-溶血圈；ZL3和ZL5可形成圓形、微隆起、表面濕潤光滑、灰白色、半透明、菌落大小為0.5~ 1 mm的菌落，但在血瓊脂平板上不能形成溶血圈。經革蘭氏染色、生理生化、16S rRNA序列比對和基因序列進化樹分析，鑒定ZL1株為溫和氣單胞菌()，ZL3和ZL5株為遲緩愛德華菌()。藥敏實驗結果顯示，ZL1株對慶大霉素、米諾環(huán)素、頭孢他啶等藥物高度敏感，對鏈霉素、青霉素、克拉霉素等耐藥；ZL3和ZL5株對左氧氟沙星、鏈霉素和恩諾沙星敏感，對慶大霉素、氨芐西林、青霉素、復方新諾明等藥物耐藥。人工感染結果顯示，分離菌均具有明顯致病性。

河鱸；溫和氣單胞菌；遲緩愛德華菌；鑒定；藥敏實驗

河鱸(Linnaeus)，地方名為五道黑，屬于鱸形目(Perciformes)、鱸科(Percidae)、鱸屬()，是肉食性兇猛魚類，廣泛分布于歐洲、亞洲北部和美洲北部，在我國僅產于新疆的額爾齊斯河和烏倫古湖水域(唐富江等, 2009)，是新疆額爾齊斯河重要的土著經濟魚類之一(任慕蓮等, 2002)，有生長速度快、抗病能力強等特點，其肉質鮮美，市場需求十分緊俏(唐富江等, 2008)。近年來，由于過度捕撈和環(huán)境因素的影響，河鱸野生資源量大幅下降，目前已開展人工養(yǎng)殖。2016年5月，新疆五家渠某池塘人工養(yǎng)殖河鱸出現(xiàn)食餌量下降、精神萎靡、對外界刺激反應不靈敏、時而側游的現(xiàn)象，病魚有肛門紅腫、腹部膨大、體表鱗片脫落、爛尾爛鰓等癥狀，發(fā)病水溫高(25℃)，每個池子死亡數(shù)達250~350尾/d，造成巨大的經濟損失。通過臨床剖檢、寄生蟲學、細菌學、病理學等方法進行了診斷，在體表發(fā)現(xiàn)有錨頭鳋()，但寄生數(shù)量不多，不是造成河鱸死亡的首要因素，在排除了寄生蟲感染和病毒感染造成死亡的情況下，懷疑是細菌感染所致。剖檢病魚內臟，進行細菌分離純化，通過革蘭氏染色、生理生化實驗、藥物敏感性實驗、分子生物學實驗對分離菌進行了初步鑒定，在此基礎上通過測序對細菌16S rRNA基因序列進行分析，并構建進化樹，以探討分離菌在所屬菌群中的分類位置。本研究旨在豐富河鱸細菌病病原研究資料，并為河鱸細菌病的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

來自新疆五家渠某養(yǎng)殖場的患病河鱸16尾，病魚有鱗片脫落、腹部膨脹、肛門紅腫外突的癥狀。體長約為15~28 cm，體重約為170~300 g，用于臨床剖檢、病料采集和病原菌分離。剖檢時，已有部分魚翻肚、死亡。實驗用河鱸為該場未發(fā)病同批次魚池，體長約為12~22 cm，體重約為145~250 g，在實驗室暫養(yǎng)3周，確定健康無病后，用于回歸感染實驗。

LB肉湯、LB瓊脂、M-H培養(yǎng)基購自青島日水生物技術有限公司；細菌微量生化實驗管、革蘭氏染液、藥敏紙片購自杭州天河微生物試劑有限公司；細菌16S rRNA通用引物、序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；膠回收試劑盒購自OMEGA生物科技有限公司；質粒提取試劑盒購自全式金生物科技有限公司。

1.2 剖檢觀察

肉眼檢查病魚體表有無甲殼類寄生蟲，同時，分別刮取鰓絲粘液和體表粘液，在體視顯微鏡下觀察粘液中有無寄生蟲(趙江山等, 2011)。依次檢查魚頭、腹、鰭、肛門有無病變；剖開腹部，檢查有無腹腔液，肝臟、膽囊、脾臟和腎臟等器官質地、形態(tài)，有無出血，腸壁彈性及腸道內容物。

1.3 細菌分離培養(yǎng)

無菌條件下，采集病魚腹腔液、肝臟、脾臟、腸和腎臟。腹腔液用接菌環(huán)蘸取，在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線；內臟用滅菌手術剪剪開，用橫斷面在LB瓊脂培養(yǎng)基上涂抹，再持接菌環(huán)在涂抹處劃線，20℃倒置培養(yǎng)16~24 h。挑取形態(tài)一致的單個優(yōu)勢菌落，進行分離傳代純化培養(yǎng)。

1.4 細菌鑒定

挑取瓊脂平板上單菌落，經稀釋、涂片、固定和染色后，顯微鏡油鏡下觀察菌體形態(tài)和顏色，鏡下觀察菌體單一后，挑取單個菌落接種于Mueeller- Hinton(M-H)液體培養(yǎng)基，置于20℃恒溫搖床，培養(yǎng)24 h，用培養(yǎng)的菌液進行V-P、H2S等生理生化實驗，實驗結果參照房海等(2014)進行分析。

分離純化的細菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，于 20℃恒溫搖床培養(yǎng)24 h后，用30%甘油與菌液6∶4加到EP管中混勻封口，作為菌種保存。以菌液為底物，進行菌液PCR。選用細菌通用引物擴增16S rRNA(正向引物27F: 5￠-AGAGTTTGATCCTGC-3￠；反向引物1492R: 5￠-GGTTACCTTGTTACGACTT-3￠)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應體系(25 μl)：Super mix 12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物 1 μl，底物2 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，54℃退火60 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，連接轉化并提取質粒，質粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果在NCBI上Blast比對，用MEGA6.0軟件對序列進行多重比較，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 致病菌藥敏實驗

吸取100 μl M-H液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液，均勻涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基表面，用燒灼后的無菌鑷子夾取藥敏片，以適當間隔粘貼于瓊脂培養(yǎng)基表面，并輕壓藥敏片，使之與培養(yǎng)基充分接觸。正置0.5 h，然后，倒置于20℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16~24 h后，觀察并測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈的大小來判斷該菌對相應藥物的敏感程度(尚紅等, 2015)。

1.6 病理組織切片

將健康魚和患病魚的肝臟和腸體完整切下并保存在4%甲醛中，按照病理組織切片法(李鈺等, 2014)，采用LEICA RM2235手搖連續(xù)切片機進行石蠟組織切片，并對切片進行染色，鏡下對比病變內臟切片與健康內臟切片間組織的變化。

1.7 回感實驗

實驗設3個濃度組，每個濃度組2個梯度濃度，高濃度組：1×109、1×108CFU/ml；中濃度組：1×107、1×106CFU/ml；低濃度組：1×105、1× 104CFU/ml。測定3個目標菌液在OD600 nm下的吸光值，用無菌生理鹽水調至相同后，再稀釋成相應濃度的細菌懸濁液。每尾腹部肌肉注射0.1 ml，對照組注射等量的無菌生理鹽水，每組注射10尾，保持水溫為20℃，不間斷供氧，連續(xù)觀察7 d，每天定時投喂，觀察并記錄實驗魚的癥狀及每天死亡數(shù)目，死魚及時撈出并剖檢，檢查其體表及內臟器官的病變情況并做記錄，同時，進行細菌分離。參考累積法(Reed-Muench)計算半數(shù)致死量(LD50)。

2 結果與分析

2.1 體表檢查及病理剖檢結果

在魚背鰭基部和腹部發(fā)現(xiàn)錨頭鳋，剝落之后，鱗片基部有出血，魚腹部膨脹，肛門紅腫外突，嚴重者輕壓腹部可見淡黃色液體從肛門流出。剖開腹部，有腹水；肝臟腫大，出血不明顯；腸壁淤血嚴重，腸道內幾乎沒有食物，整個腸道有大量膠胨狀黃色黏液，腸壁變薄且無彈性。

2.2 致病菌形態(tài)特征

從患病魚肝臟、腸道分離得到優(yōu)勢菌，革蘭氏染色均為陰性短桿菌，無莢膜，也不形成芽孢，菌體成對或單獨存在，有時可見首尾相連，形成有弧度的長鏈狀菌體，但是，調節(jié)細準焦螺旋可見是由幾個單獨的短桿菌形成；在LB瓊脂培養(yǎng)基上，ZL1可形成邊緣整齊、微隆起、表面光滑、淺黃色、有特殊芳香氣味、菌落大小為1.5~2 mm (20℃, 24 h)的菌落，且在血瓊脂平板上能形成明顯的β-溶血圈；ZL3和ZL5可形成圓形、微隆起、表面光滑且濕潤、灰白色、半透明、菌落大小為0.5~1 mm (20℃, 24 h)的菌落，在血瓊脂平板上不能形成溶血圈。

2.3 生理生化結果

生理生化反應顯示，ZL1株產酸不產氣，能利用V-P、蔗糖、葡萄糖、明膠、枸櫞酸(Simmons)；在含5% (/) NaCl的培養(yǎng)基中能生長，高于6%不生長；不利用果糖、水楊苷、纖維二糖、H2S、酒石酸、阿拉伯糖。ZL3、ZL5株產酸、產氣，能利用葡萄糖、硫化氫；在含4% NaCl的培養(yǎng)基中能生長，高于5%不生長；V-P、明膠、枸櫞酸反應陰性；不利用蔗糖、果糖、水楊苷、纖維二糖、阿拉伯糖、酒石酸(表1)。

2.4 PCR鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

對分離菌16S rRNA進行PCR擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳可見，片段長度約為1600 bp。把測序反饋序列上傳NCBI進行基因序列比對，結果顯示，ZL1株為溫和氣單胞菌，ZL3、ZL5 2株菌為遲緩愛德華氏菌。將3株菌序列在EzBioCloud上同時進行比對，結果與NCBI比對結果相同，其中，ZL1株的相似率為99.78%，ZL3的相似率為99.17%，ZL5的相似率為99.31%。初步修飾后將序列上傳NCBI并獲得3個序列號(MF767618、MF980985和MF992220)。選擇8個氣單胞菌屬標準參考株，運用Mega 6.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹，以為外類群，所做進化樹顯示，ZL1與上海株KX692881聚為1支，置信度為88 (圖1)。

表1 分離菌的生理生化特性

Tab.1 Physiological-biochemical characteristics of isolated bacteria

+：陽性；–：陰性；±：生長緩慢。*：參考文獻(房海等, 2010)

+: Positive; –: Negative; ±: Slow growth. *: Reference (Fang,, 2010)

選擇12個愛德華氏菌屬標準參考株，以維氏氣單胞菌(KY767542)為外類群，所做進化樹顯示，ZL3與四川株KF872771聚為1支，置信度為67；ZL5與廣州株JX393017聚為1支，置信度為72 (圖2)。

圖1 基于分離菌株ZL1 16S rRNA基因與同源性菌株相應基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 基于分離菌株ZL3和ZL5 16S rRNA基因與同源性菌株相應基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 藥敏實驗結果

用21種水產常用藥進行藥敏實驗，藥敏實驗判定結果參照美國臨床實驗室標準化委員會VET01-A4標準(表2)。結果顯示，ZL1株對慶大霉素、米諾環(huán)素、頭孢他啶等藥物高度敏感；對鏈霉素、青霉素、克拉霉素、哌拉西林、卡那霉素等耐藥。ZL3株對恩諾沙星、左氧氟沙星、鏈霉素敏感；對慶大霉素、青霉素、復方新諾明等藥物耐藥。ZL5株對左氧氟沙星、鏈霉素、恩諾沙星敏感；對慶大霉素、氨芐西林、青霉素、復方新諾明等藥物耐藥。

2.6 病理組織切片

正常腸道由內向外分為粘膜、粘膜下層、肌層和外層，其中，粘膜和粘膜下層向腸道內突出形成褶皺狀的腸絨毛。通過病理組織切片染色，可觀察到病魚腸粘膜變性壞死(圖3A)，腸道細胞呈凝固性壞死 (圖3B)。正常肝臟細胞呈多邊形，邊緣整齊，細胞核在中間(圖3D)；而病魚肝臟炎性細胞浸潤，脂肪空泡變性(圖3C)。

表2 病原菌的藥敏實驗結果

Tab.2 Results of antibiotic sensitivity test of strain pathogenic bacteria

注：R：耐藥；I：中度耐藥；S：敏感

Note: R: Resistant; I: Intermediately resistant; S: Sensitive

2.7 致病菌回感實驗

為了探究主要致病菌，進行分組人工回感實驗。腹部肌肉注射ZL1 6 h后，可見高濃度組游動緩慢；12 h后，高濃度組開始出現(xiàn)翻肚的現(xiàn)象，且腹部注射處皮膚紅腫；18 h后，開始有死亡現(xiàn)象；96 h后，高濃度Ⅱ組全部死亡；8 d內高濃度組全部死亡。

人工腹部肌肉注射ZL3、ZL5后，首日高濃度組可見死亡，ZL5低濃度組也出現(xiàn)死亡，懷疑是注射時魚體的應激所造成。實驗魚注射12 h后，高濃度組出現(xiàn)翻肚側游現(xiàn)象，且腹部注射處皮膚紅腫；18 h后，ZL5組死亡4尾，ZL3組死亡2尾；96 h后，ZL5高濃度Ⅱ組全部死亡；7 d內ZL5高濃度組全部死亡；15 d內ZL3高濃度組全部死亡。

將ZL1、ZL3和ZL5等濃度混勻，人工腹部肌肉注射0.1 ml，正常飼養(yǎng)3 h后，高濃度組和中濃度組出現(xiàn)側游情況；6 h后，有魚死亡；48 h后，高濃度幾乎全部死亡；中濃度Ⅱ組在5 d全部死亡。

實驗期間，高濃度組在注射菌液后正常投喂期間，進食量明顯低于低濃度組；發(fā)病時間短于低濃度組；注菌各組發(fā)病癥狀相似，從各組死亡與瀕臨死亡的實驗魚肝臟、腸道等處分離得到與ZL1、ZL3、ZL5的形態(tài)、生理生化特征相一致的細菌。ZL1、ZL3和ZL5的LD50依次分別為8.91×105、4.47×104和1.12×104CFU/ml，混合組的LD50為0.32×104CFU/ml。對照組飲食正常，沒有死亡。結果顯示，分離菌都具有致病性，其中，遲緩愛德華菌(ZL3和ZL5)的致病力更強(表3)。

3 討論

3.1 溫和氣單胞菌和遲緩愛德華菌對水產業(yè)的危害

圖3 病理組織切片

A：病變腸道縱切面；B：腸粘膜變性壞死；C：肝臟炎性細胞浸潤、脂肪空泡變性；D：正常肝臟

A: Infected intestinal longitudinal section; B: Intestinal mucosal degeneration and necrosis; C: Liver inflammatory cells infiltration, hepatic fatty vacuolar degeneration; D: Normal liver

遲緩愛德華菌能引起人的腦膜炎、腹膜炎、敗血癥、軟組織感染、腸道疾病，在熱帶和亞熱帶最為常見(Schlenker, 2009)，中國臺灣報道的22例腸道感染病例中，死亡率為23%，因此，提出將此菌作為腸道感染常規(guī)檢查內容，以腹瀉病病原菌高度重視(Wang, 2005)。崔新鳳等(2006)臨床報道稱，該菌也可造成肝膿腫。

3.2 分離菌藥敏結果分析及中藥防控優(yōu)勢

通過以上藥敏實驗，可見溫和氣單胞菌對鏈霉素、青霉素、克拉霉素、哌拉西林、卡那霉素等藥耐受，對水產常用藥氟苯尼考、左氧氟沙星、恩諾沙星等藥呈中度耐受。本結果與梁利國等(2013)和胡琳琳等(2008)的研究結果相似，但與楊移斌等(2017)的研究結果有所不同。2株遲緩愛德華菌對慶大霉素、氨芐西林、青霉素、復方新諾明耐藥，對氟苯尼考、卡那霉素、阿米卡星中度耐受，與劉韜等(2014)的研究結果相似，實驗結果不同可能是和漁場日常使用抗生素的不同有關，重復的使用一種抗生素，是造成細菌耐藥的主要原因之一。據(jù)報道，使用中草藥治療魚類細菌病具有安全、綠色、環(huán)保、減少耐藥性、降低生產成本、提高魚體抵抗力的優(yōu)點，使其在防控魚類細菌病中有一定的優(yōu)勢。陳曉利(2010)報道，五倍子、黃芩和楊樹花對溫和氣單胞菌抑菌效果較好。梁利國等(2010)、高桂生等(2016)和金潔南(2016)也對溫和氣單胞菌進行過中草藥抗菌研究，結果表明，使用中草藥治療氣單胞菌引起的水產病害是可行的。陳言峰等(2011)和劉春等(2013)使用五倍子和石榴皮對遲緩愛德華菌進行體外抑菌實驗，證明二者抑菌作用明顯。張文青等(2012)實驗證明五倍子、五味子和烏梅對嗜水氣單胞菌有明顯抑菌作用。這些結果均可為溫和氣單胞菌、遲緩愛德華菌感染引起的水生動物細菌病的中草藥治療提供科學、安全的用藥依據(jù)。

表3 人工回感實驗

Tab.3 Artificial experimental infection

河鱸是我國僅分布于額爾齊斯河和烏倫古湖的一種名貴冷水性魚類，本研究首次對人工養(yǎng)殖的河鱸進行了細菌病的研究，從其體內分離并鑒定出2種致病菌，且均具有較高的致病性及致死性。目前，以河鱸等為代表的額爾齊斯河土著魚類的養(yǎng)殖較為活躍，其細菌病的防控不容小覷。

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Isolation, Identification, and Antibiotic Sensitivity of Bacillary Enteritis inLinnaeus

YANG Kunming, GUO Aimin, MA Jiangxia, DUAN Chengren, XIE Zhisheng, YUE Cheng①

(College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052)

The current development of Xinjiang indigenous fishlarge-scale farming has been listed for the positioning and development of aquaculture in Xinjiang.Linnaeus is an indigenous fish and peculiar to the Ergis River in Xinjiang.is a cold-water fish, but very few studies have investigated cold-water fish diseases, including bacterial disease. Presently, artificial breeding of perch is being initiated. However, there have been few analyses of disease in perch. In 2016, a large number of perch in the Wujiaqu Fisheries Extension Station died suddenly. Diseased fish exhibited anal swelling, abdominal swelling, surface scale cast-off, rotten tail, and rotten gill symptoms. The dominant bacterial strain was isolated from the fish liver and intestines.After culturing for 24 h at 20℃, ZL1 formed neat edges with a slight uplift in the middle, a smooth surface, a light-yellow color, a special aromatic odor, and bacterial colonies 1.5~2 mm in size. It formed a clear β-hemolysis circle on blood agar. ZL3 and ZL5 formed a round, slightly uplifted, smooth, moist, off-white, translucent, colony of 0.5~1 mm in size, but did not form a hemolysis circle on blood agar. The isolated bacteria were cultured, the bacterial species were identified, and drug susceptibility and pathogenicity tests were performed. Pathogenicity tests and morphological observation showed that the isolates had obvious pathogenicity. Gram staining, physiological and biochemical characteristics, analysis of 16S rRNA gene sequences, and phylogenetic tree development identified ZL1 asand ZL3 and ZL5 as. Drug sensitivity test showed that ZL1 was highly sensitive to gentamycin, minocycline, and ceftazidime, and resistant to streptomycin, penicillin, and clarithromycin. ZL3 and ZL5 were highly sensitive to levofloxacin, streptomycin, and enrofloxacin, and resistant to gentamicin, ampicillin, penicillin, and sulfamethoxazole.

Linnaeus;;; Identification; Drug sensitive test

YUE Cheng, E-mail: yuechengxnd@aliyun.com

楊昆明, 郭愛民, 馬江霞, 段成任, 謝志勝, 岳城. 河鱸細菌性腸炎致病菌的分離、鑒定及藥敏實驗. 漁業(yè)科學進展, 2018, 39(6): 42–51

Yang KM, Guo AM, Ma JX, Duan CR, Xie ZS, Yue C. Isolation, identification, and antibiotic sensitivity of bacillary enteritis inLinnaeus. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 42–51

* 國家自然科學基金項目(31360644)、國家科技支撐計劃項目(2012BAD25B10-03)、新疆維吾爾自治區(qū)推廣項目(2016C03013)和新疆農業(yè)大學研究生科研創(chuàng)新項目(XJAUGRI2016006)共同資助[This work was supported by National Natural Sciences Foundation of China (31360644), National Science-Technology Support Plan Projects (2012BAD25B10-03), Xinjiang Uygur Autonomous Region Scientific and Technological Projects (2016C03013), Xinjiang Agricultural University Graduate Student Scientific Research Innovation Projects (XJAUGRI2016006)]. 楊昆明，E-mail: ykunming@aliyun.com

岳 城，教授，E-mail: yuechengxnd@aliyun.com

2017-12-05,

2017-12-22

10.19663/j.issn2095-9869.20171205002

S941.42

A

2095-9869(2018)06-0042-10

(編輯 馬璀艷)