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    轉(zhuǎn)透明顫菌血紅蛋白基因里氏木霉菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的能力研究

    2018-12-18 10:19:26左婕嚴琳王安陳啟月伍紅
    四川畜牧獸醫(yī) 2018年12期
    關(guān)鍵詞:等高線氮源碳源

    左婕,嚴琳,王安,陳啟月,伍紅

    (西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041)

    纖維素酶是降解天然纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱[1],其主要來源為微生物。里氏木霉菌(Trichoderma reesei)為好氧絲狀真菌,在工業(yè)上用于生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類[2],是公認的產(chǎn)纖維素酶最高的菌株之一[3],具有產(chǎn)量高、易培養(yǎng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[4]。透明顫菌為專性好氧革蘭氏陰性絲狀菌,在低氧環(huán)境中能夠合成可溶性的透明顫菌血紅蛋白(VHb)而旺盛生長。研究發(fā)現(xiàn),當氧濃度較低時,該蛋白可以結(jié)合氧增大表達量,提高宿主菌攝氧和能量利用效率,使宿主菌在限氧條件下保持高水平的細胞生長和蛋白質(zhì)合成,在工程菌中得到廣泛運用[5-7]。

    本試驗比較了轉(zhuǎn)透明顫菌血紅蛋白基因里氏木霉菌株和普通里氏木霉菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的能力,并利用響應(yīng)面法[8-11]優(yōu)化了轉(zhuǎn)透明顫菌血紅蛋白基因里氏木霉菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件,為該基因工程菌株在未來生產(chǎn)實際中的應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 轉(zhuǎn)透明顫菌血紅蛋白基因里氏木霉Tu6-VHb菌株、里氏木霉Tu6菌株,均由中國科學(xué)院微生物研究所提供。

    1.1.2 斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉20g、尿苷1.221g,蒸餾水1000mL,pH值自然。

    1.1.3 固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 向不同碳源配比的固體培養(yǎng)物中(固體發(fā)酵培養(yǎng)基總量為4g)加入不同氮源配比的Mandels營養(yǎng)液(營養(yǎng)液氮源添加總量為2.5g/L)及尿苷(1.221g/L)。

    1.2 方法

    1.2.1 固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 吸取已保存菌液于PDA培養(yǎng)基平板中央,30℃恒溫培養(yǎng)6~7 d。待孢子成熟,加入適量生理鹽水過濾除去菌絲體,并計數(shù)得到1×106個/mL孢子懸浮液,按6%的體積分數(shù)接種于固體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)72h。

    1.2.2 提取纖維素酶粗酶液 固體發(fā)酵結(jié)束后加入40mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值4.8),30℃振蕩提取60min,隨后將溶液以8 000 r/min離心10min,取上清液。

    1.2.3 纖維素酶活力測定 向試管中加入0.5mL粗酶液和1 mL pH值4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液,預(yù)熱到50℃,加入50mg濾紙條,50℃水浴60min后加入3mL DNS,煮沸5 min,冰上冷卻,加蒸餾水定容至25mL,540nm波長測OD值,計算酶活。纖維素酶濾紙酶活力的定義:在pH值4.8、溫度50℃條件下,每分鐘催化底物水解生成1μg葡萄糖的酶量為1個活力單位U。

    1.2.4 Plackett-Burman試驗(P-B試驗) 取單因素,分別為碳源配比、氮源配比、初始含水量、接種量、發(fā)酵時間、吐溫-80含量、初始pH值,設(shè)高低兩個水平,以濾紙酶活力為指標,通過SPASS對單因素數(shù)據(jù)進行分析,然后用Design expert 8.0進行P-B試驗設(shè)計,篩選出影響Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的3個重要因素。

    1.2.5 最陡爬坡試驗 響應(yīng)面只有在臨近最佳值時才能建立有效的響應(yīng)面方程。最陡爬坡法以響應(yīng)值變化的梯度方向為爬坡方向,根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長,快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

    1.2.6 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(B-B試驗) B-B試驗采用響應(yīng)面法,設(shè)計對Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的分析試驗。根據(jù)擬合出的二次多項式,得到預(yù)測值和最佳發(fā)酵條件。響應(yīng)面回歸模型為:

    式子中,Y 為預(yù)測響應(yīng)值,β0為截距,βi、βii、βij為回歸系數(shù),Xi、Xj為各個因素。

    用Design expert 8.0軟件設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗,并對試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析,確定最佳發(fā)酵條件,依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖和等高線圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Tu6-VHb菌株和Tu6菌株產(chǎn)纖維素酶活力的比較與分析 Tu6-VHb菌株和Tu6菌株在相同培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶,測得的濾紙酶活力見圖1。

    圖1 Tu6-VHb和Tu6在120h內(nèi)所產(chǎn)酶活力的比較

    由圖1可知,隨著發(fā)酵時間的增加,酶活力均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,成功轉(zhuǎn)入VHb基因的Tu6-VHb菌株在120 h內(nèi)的最高酶活為40.23U/g,而Tu6菌株的最高酶活為24.45 U/g,說明Tu6-VHb菌株比Tu6菌株具有更強的產(chǎn)酶能力。Tu6-VHb菌株固體培養(yǎng)第72h時酶活達到最高,因此以Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵72h為后續(xù)實驗條件。

    2.2 Plackett-Burman(P-B)試驗設(shè)計及結(jié)果分析 用Design expert 8.0軟件設(shè)計的P-B試驗因素及水平見表1,P-B試驗設(shè)計及纖維素酶濾紙酶活力的測定結(jié)果見表2,試驗各因素分析結(jié)果見表3,各因素正負效應(yīng)圖見圖2。

    由圖、表可知,按影響Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的程度,各因素的重要性從高到低依次為碳源配比、初始pH值、氮源配比、初始含水量、吐溫-80、接種量、發(fā)酵時間。其中,初始含水量、吐溫-80、接種量、發(fā)酵時間影響為負效應(yīng),碳源配比、初始pH值、氮源配比影響為正效應(yīng)。因此,確定碳源配比、初始pH值及氮源配比為最陡爬坡試驗的重要因素。

    表1 P-B試驗設(shè)計各因素及其水平

    表2 P-B試驗設(shè)計及酶活測定結(jié)果

    表3 P-B試驗分析結(jié)果

    圖2 P-B試驗各因數(shù)的正負效應(yīng)圖

    2.3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果 由P-B試驗可知3個重要因素的影響均為正效應(yīng),因此設(shè)計各因素水平依次遞增的最陡爬坡試驗,試驗設(shè)計及酶活測定結(jié)果見表4。

    表4 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

    由表4可知,在最陡爬坡試驗中,隨著碳源配比、初始pH值和氮源配比各因素水平不斷遞增,相對應(yīng)的酶活呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當碳源配比為3:1,初始pH值為5,氮源配比為1時,對應(yīng)的酶活達到最高(121.51 U/g),可作為3因素響應(yīng)的最大值區(qū)域。由此確定3因素最適水平,并以此設(shè)計后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

    2.4 Box-Behnken(B-B)試驗設(shè)計及結(jié)果

    2.4.1 B-B試驗設(shè)計 以3因素最適水平為中心值,設(shè)計響應(yīng)面試驗的3因素3水平,見表5。

    2.4.2 B-B試驗結(jié)果與分析 依據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計進行固體發(fā)酵,以纖維素酶濾紙酶活力為指標進行分析。響應(yīng)面試驗設(shè)計及酶活測定結(jié)果見表6,試驗結(jié)果分析見表7。

    表5 B-B試驗因素及其水平

    表6 B-B試驗設(shè)計及酶活測定結(jié)果

    表7 B-B試驗結(jié)果回歸分析

    由表7可知,該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.8841,說明88.41%的試驗結(jié)果可由該模型解釋,建立的模型較為準確;回歸模型 P值=0.014 2(P<0.05),模型顯著。失擬性P值=0.0717(P>0.05),失擬性不顯著,模型沒有失擬現(xiàn)象。模型的線性、平方的影響是顯著的,交互作用影響不顯著。

    經(jīng)過回歸擬合后,得到回歸方程:

    酶活(U/g)=128.33-4.34×A-1.61×B-10.86×C-6.57×A×B-2.57×A×C-10.94×B×C-19.50×A2-13.00×B2-27.57×C2

    式中,A為碳源配比,B為初始pH值,C為氮源配比。

    根據(jù)該回歸方程,當 A=2.89、B=5.02、C=0.90時,模型預(yù)測最大響應(yīng)值R=129.61U/g。

    2.4.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果畫出3個因素兩兩之間的響應(yīng)曲面,其中曲面最高點表示酶活最大值;再繪出等高線密度圖,根據(jù)等高線密集程度判斷兩因素對產(chǎn)酶的影響。

    從畫出的響應(yīng)曲面圖可知,當?shù)磁浔葹?.02時,碳源配比從2.00遞增到4.00,初始pH值從4.50遞增到5.50,測得纖維素酶酶活先增大后減小,二者交互影響,構(gòu)成一個曲面,曲面最高點為酶活力最大值;當初始pH值為0.90時,碳源配比從2.00遞增到4.00,氮源配比從0.50遞增到1.50,測得纖維素酶酶活先增大后減小,二者交互影響,構(gòu)成一個曲面,曲面最高點為酶活力最大值;當碳源配比為2.89時,初始pH值從4.5遞增到5.50,氮源配比從0.50遞增到1.50,測得纖維素酶酶活先增大后減小,二者交互影響,構(gòu)成一個曲面,曲面最高點為酶活力最大值。

    由等高線密度圖觀察可得,碳源配比的等高線密度高于初始pH值的等高線密度,表明碳源配比對Tu6-VHb菌株產(chǎn)纖維素酶的影響大于初始pH值的影響;碳源配比的等高線密度要高于氮源配比的等高線密度,表明碳源配比對Tu6-VHb菌株產(chǎn)纖維素酶的影響大于氮源配比的影響;初始pH值的等高線密度高于氮源配比的等高線密度,表明初始pH值對Tu6-VHb菌株產(chǎn)纖維素酶的影響大于氮源配比的影響。該結(jié)果亦與P-B試驗的結(jié)果相一致。

    2.4.4 模型驗證 由響應(yīng)面試驗預(yù)測出Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最大酶活力為129.61 U/g。按照 A=2.89、B=5.02、C=0.90 進行 3組重復(fù)試驗,取平均值得123.81U/g,與預(yù)測值相近,證明模型有效。由此,根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件為:碳源配比(即麩皮與稻谷桿的比例)為2.89,初始pH值為5.02,氮源配比(即尿素與硫酸銨的比例)為0.90。

    3 結(jié)論

    用于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法很多,如單因素法、正交法及響應(yīng)面法。響應(yīng)面法是一種考慮多因素交互作用并找到最佳組合及作用水平的優(yōu)化法,是目前國內(nèi)外常用的一種方法。

    Tu6-VHb菌株由于向Trichoderma reesei中轉(zhuǎn)入了VHb基因,增強了Tu6-VHb菌株的呼吸頻率,促進了Tu6-VHb菌株在限氧條件下的生長繁殖,有利于Tu6-VHb菌株進行固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)酶量較Tu6菌株提高了61%。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上,對Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件進行了響應(yīng)面法優(yōu)化,最終得到最佳產(chǎn)酶條件為:碳源配比(即麩皮與稻谷桿的比例,固體發(fā)酵培養(yǎng)基總量為4g)為2.89,初始pH值為5.02,氮源配比(即尿素與硫酸銨的比例,Mandels營養(yǎng)液氮源添加總量為2.5g/L)為0.90。在此最佳條件下發(fā)酵產(chǎn)酶,每克培養(yǎng)基平均可產(chǎn)纖維素酶123.81U,比未優(yōu)化前(每克培養(yǎng)基產(chǎn)纖維素酶40.23U)提高了3.08倍。

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