肝素酶、堿性成纖維細(xì)胞生長因子在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

朱敏，安云霞

（河南省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥學(xué)科，河南 鄭州 450003）

隨著對惡性腫瘤的不斷研究，人們發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移需要兩個關(guān)鍵的步驟，突破基底膜（basement membrane, BM）和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）構(gòu)成的屏障以及有新的血管生成[1-2]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[3]，肝素酶對BM、ECM中的主要物質(zhì)硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）具有降解作用，還能協(xié)同堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）等多種生物因子，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移以及新生血管的生成。本文對非小細(xì)胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer, NSCLC）患者進(jìn)行研究，分析肝素酶、bFGF在NSCLC患者中癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河南省人民醫(yī)院2012年6月—2014年6月收治的48例NSCLC患者作為研究對象。肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)按中國抗癌協(xié)會編著的《新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范》進(jìn)行判斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查和診斷符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]的患者；②均行手術(shù)治療的患者；③年齡40～80歲的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他肺部疾病的患者；②年齡在40歲以下的患者；③臨床資料不全，中途隨訪丟失的患者。術(shù)中取患者肺癌組織樣本作為觀察組，取癌旁組織樣本作為對照組。患者中男性31例，女性17例；年齡42～76歲，平均年齡（58.2±4.6）歲。TNM分期按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2009年制定的第七版肺癌P-TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：Ⅰ期患者13例，Ⅱ期患者11例，Ⅲ期患者23例，Ⅳ期患者1例。肺癌分型：其中鱗癌35例，腺癌13例。分化程度：低分化患者21例，中分化患者18例，高分化患者9例。

1.2 標(biāo)本的制備

取4%多聚甲醛- 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）固定組織，原位雜交組織固定時加入1∶1 000 DEPC，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度4μm。

1.3 試劑與免疫組織化學(xué)染色

以色列Insight公司生產(chǎn)的小鼠抗人肝素酶單克隆抗體HP-130，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)的兔抗人bFGF多克隆抗體、Plus廣譜試劑盒以及鼠抗人CD34單克隆抗體。免疫組織化學(xué)染色方法和步驟嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行操作。常規(guī)脫蠟至水，采用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓2 min抗原修復(fù)，4℃過夜，DBA顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 Western blot

肝素酶濃縮型抗體與免疫組織化學(xué)染色所用一致。采用華美生物工程公司生產(chǎn)的羊抗鼠IgG二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記）及NBT/BCIP試劑盒。選用Invitrogen公司生產(chǎn)的梯度蛋白標(biāo)準(zhǔn)。取癌旁組織剪碎，加入裂解緩沖液并攪勻，離心機(jī)低溫4℃離心，13 000 r/min離心30 min，提取上清液作為細(xì)胞總蛋白。10% SDSPAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)印，5%牛血清封閉，1∶500稀釋一抗4℃過夜孵育，1∶1 000稀釋二抗室溫孵育1 h，NBT/BCIP顯色30 min。

1.5 原位雜交

采用武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的肝素酶原位雜交試劑盒（MK2156）進(jìn)行原位雜交。肝素酶靶基因mRNA正向引物：5'-CCAAGCTAA GATCAGCTCAGTTC-3'，反向引物：5'-CATCTAAGCGC AACTTTGGAG-3'。石蠟切片的制備和雜交均嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。從雜交液中去除探針為陰性對照。

1.6 觀察指標(biāo)

觀察兩組標(biāo)本中肝素酶和bFGF的表達(dá)情況，分析肺癌組織中肝素酶和bFGF的表達(dá)與肺癌臨床病理因素的關(guān)系。隨訪患者3年，分析影響NSCLC患者預(yù)后的危險因素。觀察根據(jù)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，染色強(qiáng)度為陽性細(xì)胞比例評定標(biāo)準(zhǔn)。在光鏡下隨機(jī)抽取10個高倍視野，按每個視野100個細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。染色強(qiáng)度分級[5]：0級，胞質(zhì)或包膜無染色；Ⅰ級，胞質(zhì)或包膜呈淡棕黃色；Ⅱ級，胞質(zhì)和包膜呈棕黃色或更深。陽性細(xì)胞數(shù)分級[6]：0級，陽性細(xì)胞所占比例≤50%；Ⅰ級，陽性細(xì)胞所占比例為51%～75%；Ⅱ級，陽性細(xì)胞所占比例＞75%。兩項(xiàng)目結(jié)果相加大于Ⅱ級為陽性病例。Westem blot結(jié)果判定[7]，陽性：轉(zhuǎn)印膜出現(xiàn)藍(lán)紫色條帶。原位雜交以細(xì)胞群中淡棕黃色和棕黃色染色超過10%為陽性表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Logistic回歸方程進(jìn)行計算，以患者生存情況作為因變量，以肺癌病理因素作為自變量，逐步篩選α入=0.05，α出=0.10，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝素酶、bFGF表達(dá)情況

觀察組肝素酶陽性例數(shù)38例（79.17%），bFGF陽性例數(shù)37例（77.08%）。對照組肝素酶、bFGF均為陰性表達(dá)，觀察組肝素酶、bFGF陽性表達(dá)率高于對照組（χ2=11.163和12.424，P=0.001和 0.000）。

2.2 肺癌組織中肝素酶、bFGF表達(dá)與病理因素的關(guān)系

肝素酶表達(dá)與NSCLC患者病理分期、血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；而bFGF表達(dá)則與NSCLC患者病理分期、分化程度、血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。見表1。

表1 肺癌組織中肝素酶、bFGF表達(dá)與病理因素的關(guān)系（n =48，例）

2.3 NSCLC患者隨訪情況

隨訪NSCLC患者3年，生存患者26例，生存率54.17%（26/48）。死亡患者22例，病死率45.83%（22/48）。

2.4 NSCLC生存和死亡患者病理資料比較

NSCLC生存和死亡患者在分化程度、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝素酶及bFGF表達(dá)上差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

2.5 NSCLC患者預(yù)后影響因素分析

將上述有差異因素帶入Logistic回歸方程分析發(fā)現(xiàn)，分化程度、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝素酶及bFGF表達(dá)均是NSCLC患者預(yù)后的影響因素。賦值說明見表3、4。

表2 NSCLC生存和死亡患者病理資料比較（n =48，例）

表3 NSCLC患者Logistic分析賦值說明

表4 NSCLC患者預(yù)后影響因素分析

3 討論

肺癌是惡性腫瘤中發(fā)病率最高的疾病之一，占人類癌癥死亡的首位，嚴(yán)重威脅患者生命健康。據(jù)數(shù)據(jù)顯示[8]，80%以上的肺癌為NSCLC，雖然治療技術(shù)和醫(yī)療水平不斷提升，但患者預(yù)后仍然差，生存率較低。肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲是影響患者生存的主要原因，因此研究肺癌轉(zhuǎn)移、侵襲的因素成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。

肝素酶是一種葡萄糖苷內(nèi)切酶，可裂解細(xì)胞BM、ECM中的HSPG，從而破壞BM和ECM的完整性，使腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲，引起人們的注意[9]。隨后研究顯示，正常情況下肝素酶僅表達(dá)于免疫器官、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等[10]。但在病理狀態(tài)下，肝素酶在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系[11]。本文對NSCLC患者進(jìn)行研究，分析肝素酶與肺癌患者病理因素的關(guān)系，結(jié)果顯示，肝素酶的表達(dá)水平與肺癌的病理分期、血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系。在蘇樹偉等[12]研究中發(fā)現(xiàn)，肝素酶表達(dá)水平與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)，根據(jù)肝素酶水平有助于預(yù)測惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。在隨訪患者3年后分析預(yù)后情況發(fā)現(xiàn)，肝素酶是NSCLC患者預(yù)后的影響因素。這是由于肝素酶表達(dá)水平越高，患者越容易發(fā)生惡性腫瘤，病理分期越高，越容易發(fā)生血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者生存率較低。

bFGF是一種強(qiáng)力促血管生成因子，具有促進(jìn)新生血管生長的效果[13]。在對bFGF的研究中發(fā)現(xiàn)，bFGF在腫瘤組織中表達(dá)水平明顯升高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤患者預(yù)后具有密切關(guān)系[14]。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，bFGF是多種惡性腫瘤預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素[15]。本研究中表明，bFGF與NSCLC患者的病理分期、分化程度、血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。而觀察患者生存情況則發(fā)現(xiàn)，bFGF陽性表達(dá)率越高，患者生存率越低。這可能是由于bFGF表達(dá)水平越高，NSCLC患者越容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管浸潤，病理分期越高，分化程度低，促進(jìn)新生血管的生成，從而降低患者生存率[16]。本研究發(fā)現(xiàn)bFGF與肝素酶具有較多共性，可能對NSCLC患者的預(yù)后造成共同影響，具體影響還需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

綜上所述，肝素酶和bFGF在肺癌組織中表達(dá)水平均較高，對肺癌患者的預(yù)后造成較大影響，可能與肝素酶和bFGF能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移以及促進(jìn)新生血管生成有關(guān)。而隨著肝素酶、bFGF水平的升高，NSCLC患者預(yù)后不良，生存率較低。