MicroRNA-9和microRNA-210檢測聯(lián)合彩色多普勒超聲診斷乳腺癌的價(jià)值*

徐靜，努爾蘭·吐爾遜，王士光，王萍，謝芳

[1.四川省人民醫(yī)院東院 超聲科，成都 610101；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)院（附屬腫瘤醫(yī)院） 影像中心，新疆 烏魯木齊 830011；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院超聲科，四川 南充 637000]

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。超聲是最常用的影像學(xué)診斷方法之一，目前多應(yīng)用美國放射學(xué)會超聲乳腺影像報(bào)告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BI-RADS）給乳腺腫塊進(jìn)行評分，但該系統(tǒng)分級所涉及的項(xiàng)目仍主要依賴醫(yī)生的主觀經(jīng)驗(yàn)[1-2]。腫瘤標(biāo)志物的檢測客觀性較好，其中人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）的蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增狀態(tài)已成為乳腺癌選擇臨床治療方案與判斷預(yù)后的重要標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，但其單項(xiàng)檢測的敏感性有限，漏診率大。因此探索更具特異性和敏感性的早期診斷方法具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。近年來，微RNA（microRNA,miRNA）在癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和增殖中的作用得到了進(jìn)一步地探索，SUN等[5]研究顯示miR-9在肝細(xì)胞癌、乳腺癌等中表達(dá)顯著升高。TOYAMA等[6]研究表明，miR-210的高表達(dá)是日本三重陰性乳腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。楊浚沨等[7]研究顯示，miRNA聯(lián)合診斷乳腺癌比HER2等單一指標(biāo)診斷具有更大的優(yōu)勢。但尚未有研究表明miRNA檢測與影像學(xué)手段聯(lián)合是否具有更高的診斷價(jià)值。因此，本研究利用miR-9、miR-210和彩色多普勒超聲對乳腺癌進(jìn)行聯(lián)合診斷，旨在為臨床早期診斷、篩查乳腺癌提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年3月至2018年3月四川省人民醫(yī)院東院乳腺外科收治的患者。均經(jīng)該院病理科術(shù)后病理確診。確診為乳腺惡性腫瘤的患者175例（乳腺癌組），其中，浸潤性癌168例（浸潤性導(dǎo)管癌165例、浸潤性小葉癌3例）、導(dǎo)管內(nèi)癌7例；平均年齡（51.01±7.18）歲；均為女性。確診為乳腺良性病變的患者162例（良性病變組），其中，乳腺上皮增生94例（腺病86例、乳腺小葉增生4例、乳腺上皮不典型增生4例）、上皮良性腫瘤62例（單純纖維腺瘤45例、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤17例）、脂肪瘤5例、感染性肉芽腫1例；平均年齡（50.80±6.91）歲；均為女性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)后病理診斷明確；②所有患者術(shù)前均未接受放化療；③精神狀態(tài)良好，生命體征平穩(wěn)，能配合研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能不全及內(nèi)分泌失調(diào)疾病等。本研究獲該院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

德國GE LOGIQ E9彩色多普勒超聲診斷儀，離心機(jī)購自美國Sigma公司，PCR儀購自美國BIO-RAD公司。miRNeasy Mini Kit試劑盒（德國QIAGEN公司），All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒（美國GeneCopoeia公司），ELISA定量試劑盒（美國Bender公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 超聲檢查 使用GE LOGIQ E9彩色多普勒超聲診斷儀，ML6-15探頭，頻率為6～15 MHz?；颊呷⊙雠P位，充分暴露雙側(cè)乳腺、腋窩及鎖骨上窩，常規(guī)超聲掃描，探頭分別做縱向、斜向、橫向及多方位掃查，觀察各乳腺病灶的形狀、走行、邊緣、回聲、周圍組織、鈣化、病變內(nèi)血管血流的阻力指數(shù)（resistance index,RI）等征像并記錄。根據(jù)上述情況，參照BI-RADS分級診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級評價(jià)[8-9]：0級，資料不完善，需結(jié)合其他檢查進(jìn)行診斷；1級，未見明顯異常；2級，良性改變，建議定期隨訪；3級，良性病變可能，建議短期隨訪；4級，可疑惡性病變（惡性概率3%～94%），建議活檢以確診；5級，高度可疑惡性病變（惡性概率＞95%）；6級，病理已確診為惡性。因此，在本研究中，認(rèn)為1～3級為良性改變，4～5級為惡性病變。

1.3.2 miR-9、miR-210檢測 采集患者手術(shù)前空腹靜脈血液標(biāo)本5 ml，加入促凝管，4℃條件下4 000 r/min離心10 min，再置于4℃條件下12 000 r/min離心15 min，分離血清。分離后的血清暫時(shí)放至-80℃冰箱冷凍保存。取100～200 μl血清，按照miRNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取血清總RNA。然后按照All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，并qRT-PCR檢測血清miR-9、miR-210濃度，表達(dá)水平的對比以U6B濃度作為內(nèi)參對照。

1.3.3 HER2檢測 采集患者手術(shù)前空腹靜脈血樣，3 500 r/min離心5 min，取上清。按照ELISA定量試劑盒說明書操作，1∶20稀釋待檢血清，配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，室溫?fù)u育2 h。酶標(biāo)儀讀取光密度（OD）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出每個(gè)樣品濃度，血清HER2＞15 ng/ml為陽性，≤15 ng/ml為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0和Medcalc統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。比較采用Logistic回歸進(jìn)行乳腺癌的影響因素分析，建立受試者工作特征曲線（ROC）分析潛在指標(biāo)診斷乳腺癌的準(zhǔn)確性，利用Logistic回歸建立彩色多普勒超聲與miR-9、miR-210檢測聯(lián)合診斷模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

圖1 乳腺良惡性腫瘤的多普勒超聲聲像圖

兩組均可觸及無痛性腫塊（共310例，占91.98%），多位于外上象限（共154例，占45.69%），腫塊質(zhì)地多較硬，也可為囊性或有柔韌感；腫塊較為固定，活動(dòng)度小。乳腺癌組患者可有乳頭濕疹樣改變，回縮固定（乳腺癌組32例，占19.75%）；乳房皮膚橘皮樣改變（乳腺癌組21例，占12.96%）等。超聲結(jié)果示：乳腺癌組腫塊邊界不清，呈鋸齒狀或蟲蝕樣向周圍組織浸潤，腫塊邊緣有厚薄不均的強(qiáng)回聲暈環(huán)；腫塊內(nèi)部為弱回聲或低回聲，有小鈣化或液化，內(nèi)部和周邊可探及豐富血流信號（見圖1A）。良性病變組腫塊邊界相對清晰，腫塊內(nèi)回聲較為均勻，內(nèi)部和周邊多無豐富血流信號（見圖1B）。

乳腺癌家族史、月經(jīng)周期不規(guī)律、BI-RADS分級惡性、HER2陽性在乳腺癌組中所占比例大于在良性病變組中的比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RI值、miR-9、miR-210表達(dá)水平在乳腺癌組中均高于良性病變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。年齡在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 乳腺癌的危險(xiǎn)因素

以患者是否患乳腺癌為因變量，進(jìn)一步分析患者乳腺癌家族史、月經(jīng)周期不規(guī)律、BI-RADS分級惡性、RI值、HER2及miR-9、miR-210表達(dá)水平對乳腺癌準(zhǔn)確診斷的影響程度，多因素Logistic分析結(jié)果顯示：乳腺癌家族史、月經(jīng)周期不規(guī)律、BI-RADS分級惡性、HER2及miR-9、miR-210表達(dá)水平對乳腺癌發(fā)生有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；分析各因素對乳腺癌準(zhǔn)確診斷的影響程度，BI-RADS分級的影響程度最高（O^R=5.702），其次為HER2陽性（O^R=4.371）。見表2。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 乳腺癌危險(xiǎn)因素的多因素分析

2.3 HER2、彩色多普勒超聲、miR-9和miR-210診斷乳腺癌的敏感性、特異性比較

以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，HER2診斷宮頸癌的敏感性為59.43%（104/175），特異性為27.78%（45/162）。彩色多普勒超聲診斷宮頸癌的敏感性為83.43%（146/175），特異性為69.14%（112/162）。血清miR-9診斷宮頸癌的AUC為0.753，敏感性為50.99%，特異性為90.63%。血清miR-210診斷宮頸癌的AUC為0.747，敏感性為51.08%，特異性94.21%（見圖2）。

2.4 彩色多普勒超聲聯(lián)合miR-9、miR-210檢測診斷乳腺癌

利用Logistic回歸模型將彩色多普勒超聲與血清miR-9、miR-210檢測進(jìn)行聯(lián)合診斷，其AUC提高到0.934，敏感性為89.78%，特異性為85.12%。見圖3。

圖2 血清miR-9、miR-210檢測診斷乳腺癌ROC曲線

圖3 彩色多普勒超聲聯(lián)合血清miR-9、miR-210診斷乳腺癌ROC曲線

3 討論

目前臨床上常用鉬靶X射線攝影作為乳腺癌篩查的主要手段，但是鉬靶X射線不能檢出較小的乳腺癌腫塊，且對致密腺體顯影較差，不利于乳腺惡性腫瘤的早期診斷。雖然彩色多普勒超聲可以彌補(bǔ)這一不足，但其對病變性質(zhì)的區(qū)別能力較低，并且應(yīng)用于臨床的BI-RADS標(biāo)準(zhǔn)多依賴于醫(yī)生的主觀判斷。近年來，基因檢測成為乳腺惡性腫瘤研究的新興熱點(diǎn)，miRNA的出現(xiàn)為乳腺癌的篩查與早期診斷提供了新的方向。然而miRNA進(jìn)行乳腺癌的早期診斷時(shí)，其敏感性較影像學(xué)手段低，且缺乏多中心大樣本量的研究支持。因此，本研究選取與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)的miR-9和miR-210作為標(biāo)志物，聯(lián)合彩色多普勒超聲，旨在為乳腺癌提供準(zhǔn)確、高效的篩查和早期診斷方式。

通過對兩組一般資料的比較發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組和良性病變組都有較高比例的乳腺癌家族史，且乳腺癌組有家族史人群比例更高，這與乳腺癌的遺傳易感性相符[10]；月經(jīng)周期不規(guī)律常與雌孕激素的失調(diào)有關(guān)，在乳腺癌組中更高比例的月經(jīng)不規(guī)律發(fā)生例數(shù)也印證該點(diǎn)[11]。在本研究中，彩色多普勒超聲可以顯示大部分腫瘤內(nèi)有典型的豐富血流、腫塊邊緣有厚薄不均的強(qiáng)回聲暈環(huán)等特點(diǎn)，但部分良性病變患者亦可見局部血流豐富，因此需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生進(jìn)行辨別，而其敏感性和特異性受限。乳腺癌組中RI值較良性病變組低，表明腫瘤內(nèi)有豐富血流，而RI值并不受醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)的影響，具有更客觀的特點(diǎn)。

新近有研究表明[12-13]，miR-9或miR-210與胃、肺、乳腺等多種腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后存在密切的關(guān)系。本研究顯示，相較于良性病變組，乳腺癌組的血清miR-9、miR-210表達(dá)量顯著升高，與既往研究一致[14]。

在多因素分析中，乳腺癌家族史、月經(jīng)周期不規(guī)律、BI-RADS分級惡性、HER2表達(dá)水平、miR-9和miR-210的表達(dá)水平均為乳腺癌發(fā)生的影響因素。然而根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，問診得到的乳腺癌家族史、月經(jīng)規(guī)律與否等信息存在一定的偏差，而HER2表達(dá)水平的敏感性低[15]，故無法作為篩查乳腺癌的主要手段。因此本研究探討miR-9、miR-210檢測聯(lián)合彩色多普勒超聲診斷乳腺癌的診斷效能。

根據(jù)ROC曲線，分別分析彩色多普勒超聲、血清miR-9、miR-210水平診斷乳腺癌的診斷效能，發(fā)現(xiàn)彩色多普勒超聲檢查敏感性較好，但依賴于醫(yī)生的主觀判斷。血清miR-9、miR-210的AUC均在0.75左右，但其敏感性和特異性無法兼顧。兩者聯(lián)合檢測可以有效提高診斷的準(zhǔn)確性，AUC提高至0.934，敏感性為89.78%，特異性為85.12%，綜合效能較獨(dú)立診斷較好。因此，miR-9、miR-210檢測聯(lián)合彩色多普勒超聲診斷乳腺癌具有較好的診斷效能。

綜上所述，miR-9和miR-210檢測聯(lián)合彩色多普勒超聲診斷乳腺癌準(zhǔn)確性較高，是一種無創(chuàng)而高效的篩查和早期診斷方法，具有較高的臨床價(jià)值，值得參考與借鑒。