神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達與意義*

李美楠，朱秀麗，曲凡，刁玉巧

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 兒科，河北 石家莊 050011）

兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤（Neuroblastoma, NB）是兒童中常見的顱外惡性實體腫瘤，起源于胚胎神經(jīng)嵴，發(fā)生于交感或副交感神經(jīng)系統(tǒng)所在部位，以腎上腺髓質(zhì)最為常見[1]。其病因未明，占全部兒童惡性腫瘤死亡率的15%，診斷時多為中晚期，目前治療效果差，預(yù)后不佳。因此，進一步研究NB的發(fā)病和進展機制，將為兒童NB的診斷和治療提供新的理論依據(jù)，有助于提高臨床療效和改善預(yù)后。目前有學(xué)者認(rèn)為兒童NB的發(fā)生與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)[2]。本研究通過檢測C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4 4種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子在兒童NB組織中的表達情況，分析其與病理類型、臨床分期、術(shù)前有無化療的關(guān)系以及4種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達之間的相關(guān)性，進一步探索這4種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子在NB發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院兒科2007年1月至2016年3月手術(shù)切除或者活檢，并經(jīng)病理確診的53例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒（實驗組）石蠟包埋組織標(biāo)本切片。其中，男性31例，女性22例；年齡1～9歲，中位年齡5歲，≤5歲的38例，＞5歲的15例。另取10例嚴(yán)重腎盂積水患兒手術(shù)后殘余的正常腎上腺組織作為對照組，所取標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。以上所有標(biāo)本均經(jīng)2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師獨立診斷，并通過手術(shù)或影像學(xué)檢查確定侵犯部位和分期。實驗組根據(jù)國際INSS分期系統(tǒng)[3]，分為Ⅲ期20例和Ⅳ期33例；按病理分型，分為節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組19例和神經(jīng)母細(xì)胞瘤組34例；按照術(shù)前是否經(jīng)放化療干預(yù)，分為術(shù)前骨髓檢查明確已有骨髓浸潤的化療組33例（化療方案按上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心制定的NB-99治療方案[4-5]）和術(shù)前骨髓檢查無骨髓浸潤的未經(jīng)過任何放化療干預(yù)直接手術(shù)切除組20例。

1.2 主要試劑

C-Myc兔抗人多克隆抗體（美國Bioworld Technology公司），Klf4兔抗人多克隆抗體（美國ProSci Incorporated公司），Oct4兔抗人多克隆抗體（美國Bioworld Technology公司），Sox2兔抗人單克隆抗體、免疫組織化學(xué)染色試劑盒（北京中衫金橋生物公司），設(shè)對照PBS代替一抗作陰性對照，選擇獲得陽性切片作為陽性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)

以下免疫組織化學(xué)結(jié)果判定在雙盲下進行，隨機選擇5個（×20）視野，計數(shù)1 000個細(xì)胞中陽性染色細(xì)胞，細(xì)胞陽性率=（陽性表達細(xì)胞數(shù)/1 000）×100%。C-Myc、Sox2及Klf4染色陽性部位均位于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞核，Oct4染色陽性部位位于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞質(zhì)。染色強度：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細(xì)胞所占的百分比：0分為陰性（無陽性細(xì)胞），1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%。按兩者乘積數(shù)將每個標(biāo)本的表達強度分為4個等級：陰性（-）Ⅰ級（0、1、2分）；弱陽性（+）Ⅱ級（3、4分）；中度陽性（++）Ⅲ級（6、8分）；強陽性（+++）IV 級（9、12分）[6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果以陽性率（%）表示，用連續(xù)校正χ2檢驗和四格表資料的Fisher確切概率法，采用Spearman等級相關(guān)分析進行相關(guān)性比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在兒童NB的表達

C-Myc、Sox2和Oct4在兒童NB的表達呈強陽性（+++）（見圖1A～C），Klf4在兒童NB的表達呈陽性（++）（見圖1D）。

圖1 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在兒童NB的表達情況

2.2 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在正常腎上腺組織中的表達

C-Myc、Sox2、Oct4和Klf4在正常腎上腺組織中的表達呈陰性。見圖2A～D。

圖2 C-Myc、Sox2、Oct4和Klf4在正常腎上腺組織中的表達

2.3 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在兒童NB的表達

對照組和實驗組的C-Myc陽性率比較，經(jīng)χ2檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.381，P=0.000），實驗組的陽性率高于對照組；節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組和神經(jīng)母細(xì)胞瘤組的陽性率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），神經(jīng)母細(xì)胞瘤組陽性率高于節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組；Ⅲ期組和Ⅳ期組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)前化療組和術(shù)前無化療組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)前無化療組的陽性表達率高于術(shù)前化療組；不同年齡、性別分組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對照組和實驗組的Sox2陽性率比較經(jīng)χ2檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.251，P=0.039），實驗組的陽性率高于對照組；節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組和神經(jīng)母細(xì)胞瘤組的陽性率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Ⅲ期組和Ⅳ期組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)前化療組和術(shù)前無化療組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)前無化療組的陽性表達率高于術(shù)前化療組；不同年齡、性別分組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對照組和實驗組Oct4的陽性率比較經(jīng)χ2檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.307，P=0.038）；節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組和神經(jīng)母細(xì)胞瘤組的陽性率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），神經(jīng)母細(xì)胞瘤組的陽性率高于節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組；Ⅲ期組和Ⅳ期組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)前化療組和術(shù)前無化療組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)前無化療組的陽性表達率高于術(shù)前化療組；不同年齡、性別分組的陽性表達率比較經(jīng)確切概率檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對照組和實驗組的Klf4陽性率比較經(jīng)χ2檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.810，P=0.030），實驗組陽性率低于對照組；節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組和神經(jīng)母細(xì)胞瘤組的陽性率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），神經(jīng)母細(xì)胞瘤組陽性率低于節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組；Ⅲ期組和Ⅳ期組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)前化療組和術(shù)前無化療組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)前無化療組術(shù)前化療組的陽性表達率低于；不同年齡、性別分組的陽性表達率比較經(jīng)Fisher精確檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1～4。

表1 對照組和實驗組4種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子陽性率比較 %

表2 節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組和神經(jīng)母細(xì)胞瘤組4種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子陽性率比較 %

表3 Ⅲ期組和Ⅳ期組4種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子陽性率比較 %

表4 術(shù)前化療組和術(shù)前無化療組4種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子陽性率比較 %

2.4 Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果

C-Myc和Sox2在兒童NB組織中的表達呈正相關(guān)（rs=0.394，P=0.023）；Sox2和 Oct4表達呈正相關(guān)（rs=0.567，P=0.010）；C-Myc與Oct4的表達無相關(guān)（rs=0.351，P=0.250）；C-Myc和Klf4表達呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.586，P=0.000）；Sox2和klf4表達呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.585，P=0.000）；Oct4和Klf4表達呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.630，P=0.000）。

3 討論

隨著對腫瘤研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中存在一小部分細(xì)胞，即TSCs細(xì)胞（tumor stem cells）與干細(xì)胞具有相似的生長調(diào)控機制，具有不斷自我更新、多向分化及高度致瘤能力。其數(shù)量雖然極少，但是在惡性腫瘤發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移、化療耐藥及復(fù)發(fā)中起著重要作用，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的根源[7]。自2006年日本科學(xué)家TAKAHASHI等[8]應(yīng)用Sox2、Klf4、Oct4和C-Myc形成誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced human pluripotent stem cell, iPS）以來，上述4種胚胎性干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子與各種類型的干細(xì)胞的研究不斷更新，而他們是否參與并促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，尚待研究。有相關(guān)文獻報道，Oct 3/4及Sox2之間可形成復(fù)合體調(diào)控下游基因表達，同時與其他基因相互作用，將LIF/Stat3，Wnt/β-catenin，JAK/STAT3，PI3K/AKT等信號通路聯(lián)系在一起，構(gòu)成調(diào)控胚胎發(fā)育的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，并在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮核心調(diào)控作用[9-14]。C-Myc蛋白是發(fā)現(xiàn)最早的與腫瘤細(xì)胞增殖活性相關(guān)的原癌基因產(chǎn)物之一，介導(dǎo)細(xì)胞外傳入細(xì)胞內(nèi)的生物信號向細(xì)胞核內(nèi)傳遞，參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)控[15-18]，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，如腎癌[19]、乳腺癌[20]、食管癌等[21]。大多數(shù)研究都表明Sox2的過表達與腫瘤的惡性生物學(xué)行為及預(yù)后不良密切相關(guān)。KIM等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的形成過程中所需的眾多基因，如Oct3/4、Sox2、Klf4、C-Myc等，只有Oct4是形成多潛能性干細(xì)胞唯一不可缺少的基因。隨著對腫瘤的深入研究，眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)Oct4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用，并與腫瘤干細(xì)胞關(guān)系密切。YANG等[23]在神經(jīng)母細(xì)胞瘤I型細(xì)胞系的研究中證實，下調(diào)Oct4的表達可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化。以上研究成果均提示，Oct4的高表達與腫瘤的高度惡性有關(guān)，可能成為判斷預(yù)后的指標(biāo)。本實驗在分析兒童NB組織中C-Myc、Sox2、Oct4和Klf4的表達情況以及彼此之間的相關(guān)性中發(fā)現(xiàn)，這4種因子在NB組織中的表達均為陽性，C-Myc與Sox2、Oct4與Sox2在兒童NB組織中的表達呈正相關(guān)，而C-Myc與Oct4的表達無關(guān)，提示C-Myc、Oct4與Sox2在兒童NB的發(fā)生、發(fā)展過程中相互協(xié)同發(fā)揮作用。Klf4與C-Myc、Oct4、Sox2在兒童NB組織中的表達呈負(fù)相關(guān)，提示Klf4與C-Myc、Oct4、Sox2在兒童NB的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用是相互拮抗的。實驗發(fā)現(xiàn)C-Myc和Oct4在節(jié)細(xì)胞-神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的表達低于其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的表達，Klf4的表達則與之相反，提示C-Myc、Oct4、Sox2可能與兒童NB組織的分化程度相關(guān)，可能成為判斷預(yù)后的指標(biāo)。因此，可設(shè)想在未來的研究中嘗試通過下調(diào)Oct4和C-Myc的表達誘導(dǎo)兒童NB向分化良好的類型分化，降低其惡性程度，改善預(yù)后。Klf4在人體內(nèi)多種組織和細(xì)胞中廣泛表達，參與多種生理功能，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、維持干細(xì)胞的全能性[24-25]等。Klf4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中，作為抑癌基因或癌基因，發(fā)揮著完全不同的作用。如Klf4可以維持乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新，促進癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮癌基因作用[26]。本研究中C-Myc、Oct4及Sox2在術(shù)前未行化療組的兒童NB組織中的表達均高于其在術(shù)前化療組的表達，而Klf4在術(shù)前未行化療組兒童NB組織中的表達低于其在術(shù)前化療組的表達，提示化療藥物對C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4的表達有影響，推測 C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4可能與化療藥物發(fā)揮作用的機制相關(guān)，可反映兒童NB的化療效果，作為判斷治療療效的指標(biāo)，有望成為NB治療的新靶點。C-Myc、Sox2、Oct4、Klf4在NB組織中的表達與年齡、性別及臨床分期無關(guān)。本研究只是發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子C-Myc、Sox2、Oct4及Klf4在兒童NB組織中的表達現(xiàn)象，還需進一步研究其與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的機制，探索更為有效的治療方法以降低兒童NB的惡性程度，提高化療療效，改善NB患兒預(yù)后。