熊果苷對(duì)黃褐斑鼠模型治療效果及機(jī)制研究

何盾，吳芳蘭，徐曉芃，廖陽(yáng)英，馮浩

（1.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 皮膚科，湖南 常德 415000；2.長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410005；3.湖南省人民醫(yī)院 皮膚科，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

黃褐斑是一種臨床常見的色素沉著性皮膚病，臨床療效欠佳，因好發(fā)于面部，臨床研究中取材困難，對(duì)治療結(jié)果的判斷比較主觀。熊果苷含有美白成分，目前臨床多用于美白。本研究復(fù)制熊果苷治療黃褐斑鼠模型，以探討其療效及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雌性純白豚鼠 50 只，體重（230±30）g，購(gòu)自并飼養(yǎng)于湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2015-0013。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 熊果苷軟膏購(gòu)自上海新先鋒藥業(yè)有限公司，黃體酮（20 mg/ml）購(gòu)自上海通用藥業(yè)股份有限公司，用滅菌注射用水稀釋。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 硫化鈉Na2S購(gòu)自濟(jì)寧百川化工有限公司，酪氨酸、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，HMB45即用型試劑盒購(gòu)自上海Dako公司。DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)購(gòu)自寧波新蘭生物科技股份有限公司，Olympus系統(tǒng)生物顯微鏡（Image-Pro Plus 6.0）購(gòu)自美國(guó)Media Cybernetics公司。

1.2 方法

1.2.1 模型復(fù)制 參照文獻(xiàn) [1-2]，以 7.5 mg/kg（相當(dāng)于人用臨床劑量的3倍）肌內(nèi)注射20 mg/ml黃體酮注射液1次，于豚鼠后腿根部連續(xù)注射30 d。豚鼠背部模型區(qū)域皮膚呈均一穩(wěn)定、邊界清晰的深褐色色斑，HMB45標(biāo)記的黑色素陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，表皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞層中可見單個(gè)散在黑色素細(xì)胞為模型復(fù)制成功。

1.2.2 分組及給藥[3]將50只豚鼠按體重隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、熊果苷軟膏低劑量治療組（0.125 g/100 g）（低劑量組）、中劑量治療組（0.250 g/100 g）（中劑量組）和高劑量治療組（0.500 g/100 g）（高劑量組）?？瞻捉M按5 ml/kg肌內(nèi)注射滅菌注射用水，其余4組均復(fù)制模型。實(shí)驗(yàn)前24 h將脊柱兩側(cè)及靠臀部皮膚用Na2S脫毛4 cm×4 cm，每周脫毛1次。熊果苷軟膏治療組模型復(fù)制成功當(dāng)天分別按比例計(jì)算局部涂擦藥物，1次/d，連續(xù)用藥30 d?？瞻捉M和模型組則予以蒸餾水局部涂抹，1次/d，時(shí)間和療程同熊果苷軟膏治療組。于末次給藥1天后處死所有豚鼠，每只豚鼠于脫毛處迅速取皮膚組織2塊備用。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 酪氨酸、MDA含量，SOD活性測(cè)定[4-5]所有豚鼠取備用皮膚組織1塊用預(yù)冷生理鹽水沖洗，除去皮下脂肪及其他結(jié)締組織后拭干，每塊皮膚組織各切取0.5 g，再分別放入盛有2.0 ml預(yù)冷生理鹽水的5根小試管內(nèi)，高速分散機(jī)以10 r/min的速度勻漿，持續(xù)10 s，重復(fù)1次，再以3 500 r/m速度離心15 min，取上清液。酪氨酸測(cè)定采用高效液相法，MDA測(cè)定用硫代巴比妥酸法，SOD測(cè)定用黃嘌呤氧化酶法，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)酪氨酸、MDA含量及SOD活性。

1.3.2 皮膚黑色素細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)觀察 所有豚鼠取備用皮膚組織1塊，約2 cm×1 cm，10%多聚甲醛固定，病理組織檢測(cè)，免疫組織化學(xué)染色，觀察黑色素細(xì)胞染色和數(shù)目，并根據(jù)文獻(xiàn)[4]判斷陽(yáng)性細(xì)胞：無(wú)，0分；＜15%，0.5分；＜30%，1分；＞30%，2分。每張切片分別觀察5個(gè)視野，找到皮膚表皮和附件上皮細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)棕色反應(yīng)的陽(yáng)性目標(biāo)后，用BX50F4北航病理圖像分析系統(tǒng)定量分析，得到每只豚鼠5個(gè)視野黑色素陽(yáng)性目標(biāo)的平均面積、目標(biāo)與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積之比（面密度）、目標(biāo)個(gè)數(shù)與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積之比（數(shù)密度）、平均灰度、平均光密度及積分光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性

各組豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組豚鼠皮膚酪氨酸、MDA含量均高于空白組，SOD活性低于空白組；與模型組比較，熊果苷軟膏治療組皮膚酪氨酸、MDA含量較低，中劑量組最低；而SOD活性則升高，中劑量組最高。見表1。

2.2 各組豚鼠黑色素細(xì)胞的面積、數(shù)量及深淺度比較

各組黑色素細(xì)胞面積、數(shù)量及深淺度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表 2、3）；由圖 1、2 可見，與空白組比較，模型組豚鼠皮膚黑色素沉著面積增大、黑色素細(xì)胞個(gè)數(shù)增多，光密度變大，著色變深；與模型組比較，熊果苷軟膏治療組豚鼠皮膚，黑色素沉著面積縮小、黑色素細(xì)胞個(gè)數(shù)減少，光密度變小，著色變淺，以中劑量組為最明顯。

表1 各組豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性比較（n =10，±s）

表1 各組豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性比較（n =10，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 酪氨酸/μg MDA/（nmol，ml） SOD/（NU/ml）空白組 0.43±0.04 10.16±2.06 105.82±15.76模型組 0.68±0.06 13.30±0.97 89.11±6.71低劑量組 0.47±0.131）2） 12.04±1.791）2） 101.06±13.661）2）中劑量組 0.45±0.091）2） 11.40±0.971）2） 103.29±11.221）2）高劑量組 0.49±0.191）2） 11.75±1.791）2） 101.63±13.181）2）F值 7.129 5.449 2.676 P值 0.000 0.001 0.044

表2 各組豚鼠黑色素細(xì)胞面積、數(shù)量比較（n =10，±s）

表2 各組豚鼠黑色素細(xì)胞面積、數(shù)量比較（n =10，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 面積/μm2 面密度 個(gè)數(shù) 數(shù)密度空白組 325.27± 48.68 0.004±0.001 1.12±0.28 1.69±0.92模型組 2 364.81±617.88 0.011±0.004 3.19±1.64 5.47±1.80低劑量組 557.16±144.541）2） 0.005±0.0021）2） 2.52±0.911）2） 2.07±0.871）2）中劑量組 381.65± 55.001）2） 0.004±0.0021）2） 1.91±0.681）2） 1.91±1.041）2）高劑量組 541.52±124.821）2） 0.005±0.0011）2） 2.31±0.501）2） 1.98±1.811）2）F值 87.601 15.623 6.805 19.323 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 各組豚鼠黑色素細(xì)胞深淺度的比較（n =10，±s）

表3 各組豚鼠黑色素細(xì)胞深淺度的比較（n =10，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 平均灰度 平均光密度 積分光密度空白組 111.45±10.79 0.29±0.05 225.19±84.55模型組 86.29±12.02 0.59±0.16 715.90±257.60低劑量組 100.66±11.941）2） 0.34±0.081）2） 395.27±124.721）2）中劑量組 105.22±11.661）2） 0.31±0.081）2） 300.92± 91.871）2）高劑量組 104.08±7.531）2） 0.33±0.081）2） 370.62±119.501）2）F值 7.361 16.201 15.772 P值 0.000 0.000 0.000

圖1 黃褐斑鼠模型及治療前免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖2 各組豚鼠治療后HMB45免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）

3 討論

黃褐斑是一種好發(fā)于中、青年女性的獲得性色素障礙性疾病，其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，影響因素眾多，可能與飲食、內(nèi)分泌失調(diào)、妊娠、化妝品使用、日光照射、精神因素及避孕藥等諸多因素相關(guān)[6]。

各種原因所致的皮膚黑色素的沉積，是黃褐斑表現(xiàn)的直接原因。黑色素是酪氨酸酶一系列氧化反應(yīng)后生成。酪氨酸在酪氨酸酶的氧化作用下，在黑素小體內(nèi)被氧化成多巴，多巴進(jìn)一步被多巴氧化酶氧化成多巴醌，多巴醌最終在酪氨酸酶的氧化下形成黑色素。由此可見，該過(guò)程中一系列的氧化與抗氧化反應(yīng)紊亂，都可能造成黃褐斑的發(fā)生、發(fā)展，而酪氨酸的增多則是黃褐斑發(fā)病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)這一系列氧化反應(yīng)平衡紊亂時(shí)，體內(nèi)將過(guò)量生成氧自由基，并且造成SOD等抗氧化酶活性降低，造成膜脂質(zhì)過(guò)氧化，形成過(guò)氧化脂質(zhì)（LPO），LPO不穩(wěn)定，迅速分解，產(chǎn)生醛類，其終產(chǎn)物——MDA相應(yīng)隨之增多，并迅速攻擊磷脂及蛋白質(zhì)，導(dǎo)致色素細(xì)胞的氧化性損傷，因而也促進(jìn)了酪氨酸酶的氧化反應(yīng)，使得黑色素增多，并于皮膚基底層顯著堆積，此即為黃褐斑等色素性皮膚疾病的發(fā)病機(jī)制之一。故而，降低皮膚組織MDA含量，提高抗氧化酶SOD活性，對(duì)黃褐斑的預(yù)防及治療有著重要意義。熊果苷提取于熊果葉，其抑制酪氨酸酶活性而達(dá)到美白效果，現(xiàn)幾乎壟斷美白市場(chǎng)。它主要通過(guò)阻斷多巴及多巴醌的合成，從而有效抑制黑色素的生長(zhǎng)，以達(dá)到去除色斑的效果。有研究證實(shí)[7]，熊果苷是一種理想的脫色素藥物，雖然抑制酪氨酸酶活性，但不影響酪氨酸酶的表達(dá)和合成。其脫色機(jī)制主要是在轉(zhuǎn)錄后階段抑制酪氨酸酶的活性，對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶家族的3種酶的含量及分子大小均無(wú)改變[8]。熊果苷包括α-熊果苷和β-熊果苷。有文獻(xiàn)報(bào)道[9-11]，α-熊果苷比β-熊果苷美白作用強(qiáng)10倍，無(wú)毒副作用，高濃度對(duì)人體細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，對(duì)紫外線灼傷導(dǎo)致瘢痕效果明顯。氫醌是最早并最廣泛應(yīng)用的美白劑，但因皮膚色素分布不均及刺激性較強(qiáng)，甚至可能致癌等原因，在美白甚至黃褐斑的治療中已被限制應(yīng)用。相比而言，熊果苷美白效果佳，毒副作用小，是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的美白劑之一，能有效抑制黑色素地生長(zhǎng)[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組皮膚酪氨酸、MDA含量升高，SOD含量降低。而模型組皮膚病理形態(tài)學(xué)觀察顯示黑色素沉著面積增大且色深。光密度反映物質(zhì)對(duì)光吸收的多少，顏色越深，目標(biāo)面積越大，則光密度值越高。熊果苷軟膏治療組皮膚酪氨酸、MDA含量降低，SOD含量升高，而低、中、高3種劑量治療組中，豚鼠模型皮膚病理形態(tài)學(xué)觀察顯示黑色素沉著面積縮小、著色變淺，尤以中劑量組最為突出，說(shuō)明熊果苷能有效抑制黑色素的生成，從而達(dá)到治療黃褐斑的效果，而不同濃度的熊果苷治療效果間有差異，本實(shí)驗(yàn)證明中等劑量（0.250 g/100 g）治療效果相對(duì)明顯，有研究[13]將熊果苷配制為10、50、100、500、1 000 μmol/L并與黑素細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 μmol/L濃度的熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性和黑色素抑制作用最為明顯，與本研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)樾芄胀ㄟ^(guò)抑制酪氨酸酶活性起作用，濃度低時(shí)未完全抑制所有酶的活性，濃度高時(shí)因活性抑制已達(dá)到飽和狀態(tài)，因而無(wú)明顯變化，而中等劑量比較合適。

綜上所述，熊果苷軟膏主要成分是熊果苷，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明它有效的增白作用，可能通過(guò)提高局部皮膚組織中SOD酶活性，明顯降低酪氨酸、MDA的含量，而抑制黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的酪氨酸酶活性，從而促使皮膚細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)，減少自由基產(chǎn)生，抑制黑色素的形成，進(jìn)而有效治療黃褐斑，熊果苷是一種安全、有效、毒副作用小的美白劑。